拟南芥乙酰乳酸合成酶基因(atals)多位点突变以及转基因过表达植株

激　光　生　物　学　报

ＡＣＴＡ　ＬＡＳＥＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＳＩＮＩＣＡ

Ｖｏｌ.２８Ｎｏ.６Ｄｅｃ.２０１９

拟南芥乙酰乳酸合成酶基因(Ａｔａｌｓ)多位点突变

以及转基因过表达植株除草剂抗性分析

文素珍ꎬ谢吉勇ꎬ钟英丽∗

(湖南农业大学生物科学技术学院ꎬ长沙４１０１２８)

摘　要:乙酰乳酸合成酶(ＡＬＳ)是支链氨基酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径中的关键酶ꎬ也是多

种除草剂的靶点ꎮ为了研究ａｌｓ基因不同突变位点组合后其抗除草剂抗性的变化ꎬ并整合和增强植株对不同类型除草剂的抗性ꎬ本研究对已知抗性位点进行组合并进行了拟南芥转基因分析ꎮ我们通过重叠延伸ＰＣＲ技术体外突变扩增四个已知位点突变的Ｐ１９７Ｓ/Ｒ１９９Ａ/Ｗ５７４Ｓ/Ｓ６５３Ｆ拟南芥Ａｔａｌｓꎬ克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ＧＦＰ载体上ꎬ从而构建了四个位点突变的ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ融合蛋白过表达载体ꎮ然后用农杆菌介导法转化野生型拟南芥Ｃｏｌ￣０ꎬ获得转基因株系ꎮ采用潮霉素抗性筛选鉴定阳性转基因植株ꎬ并利用荧光体式显微镜观察过表达植株以及在蛋白水平检测ＧＦＰ￣ｍ４Ａｔａｌｓ融合蛋白表达情况ꎮ对纯合转基因株系进行除草剂抗性分析ꎮ分析表明转基因拟南芥具有磺酰脲和咪唑啉酮两种除草剂的整合抗性ꎮ此研究有助于系统地分析ａｌｓ基因不同突变位点对抑制剂的抗性ꎬ有效避免和应对自然界ａｌｓ单一位点突变的杂草的困扰ꎮ

关键词:拟南芥ꎻＡｔａｌｓꎻ过表达ꎻ磺酰脲ꎻ咪唑啉酮中图分类号:Ｑ７５４文献标志码:Ａ

ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００７￣７１４６.２０１９.０６.０１４

ＨｅｒｂｉｃｉｄｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｕｌｔｉｓｉｔｅＭｕｔａｔｉｏｎｏｆＡｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅＳｙｎｔｈａｓｅ(Ａｔａｌｓ)ＧｅｎｅＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄＰｌａｎｔｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ

ＷＥＮＳｕｚｈｅｎꎬＸＩＥＪｉｙｏｎｇꎬＺＨＯＮＧＹｉｎｇｌｉ∗

(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈａｎｇｓｈａ４１０１２８ꎬＣｈｉｎａ)

Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＡＬＳ)ｉｓａｋｅｙｅｎｚｙｍｅｉｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｏｆｂｒａｎｃｈｅｄｃｈａｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓꎬ

ｓｉｓｔａｎｃｅａｆｔｅｒｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆａｌｓｇｅｎｅꎬａｎｄｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐｌａｎｔｓａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ.ＩｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈꎬＰ１９７Ｓ/Ｒ１９９Ａ/Ｗ５７４Ｓ/Ｓ６５３ＦｏｆＡｔａｌｓｗｉｔｈｆｏｕｒｋｎｏｗｎｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｍｐｌｉ￣ＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈｆｏｕｒｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ.ＴｈｅｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉ￣ｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓꎬｆｏｕｒｍｕｔａｔｅｄＡｔａｌｓｇｅｎｅｓｗｉｔｈｋｎｏｗｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｉｔｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏＡｒ￣ｆｉｅｄｂｙｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｅｘｔｅｎｄｅｄＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏꎬａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＣａｍｂｉａ１３００￣ＧＦＰｖｅｃｔｏｒꎬｓｏａｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｍ４Ａｔａｌｓ￣ａｎａＣｏｌ￣０ꎬｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｉ￣ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇꎬａｎｄｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ.ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｈａｄｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｕｌ￣ｖａｌｉｎｅꎬｌｅｕｃｉｎｅａｎｄｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅꎬａｎｄｉｔｉｓａｌｓｏｔｈｅｔａｒｇｅｔｏｆｍａｎｙｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅ￣

ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰ￣ｍ４Ａｔａｌｓｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ.Ｔｈｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ

ｆｏｎｙｌｕｒｅａａｎｄｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ.Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｈｅｌｐｆｕｌｔｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆａｌｓ收稿日期:２０１９￣０５￣２５ꎻ修回日期:２０１９￣０６￣１１ꎮ基金项目:国家自然科学基金项目(３１４０１４３２)ꎮ作者简介:文素珍ꎬ硕士研究生ꎮ

∗通讯作者:钟英丽ꎬ副教授ꎬ主要从事植物分子生物学研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｙｉｎｇｌｉｚｈｏｎｇ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ

　５７　２　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａꎻＡｔａｌｓꎻｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓꎻｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ

　　乙酰乳酸合成酶(ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ￣ｓｙｎｔｈａｓｅꎬＡＬＳ)是在植物、真菌和细菌中发现的一种质体酶[１]ꎬ是支链氨基酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径中Ｒｏｓｔ等[３]发现乙酰乳酸合成酶可能影响与细胞周期的关键酶[２]ꎬ在研究乙酰乳酸合成酶的作用机理时ꎬ有关的ＲＮＡ的合成而间接影响ＤＮＡ合成ꎻＲｏｙｕｅｌａ

第２８卷

ｇｅｎｅｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙａｖｏｉｄａｎｄｄｅａｌｗｉｔｈｔｈｅｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｏｆｗｅｅｄｓｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆａｌｓｉｎｎａｔｕｒｅ.

植株对５种ＡＬＳ抑制除草剂均表现出较高水平的抗性[２７￣２９]ꎮ此外ꎬ与Ｔｒｐ￣５７４￣Ｇｅｒ相比ꎬＡｌａ￣２０５￣Ｖａｌ的突变产生的抗性水平要低得多[２４]ꎮ

目前对ａｌｓ突变产生抗性的研究重点是将其快

速转化成为具有经济价值的应用ꎬ但缺乏系统性的抗性分析和研究报道ꎮ本研究整合了具有除草剂抗等[４]发现抑制乙酰乳酸合成酶ꎬ可使碳水化合物如蔗糖、淀粉在叶片(源)中大量积累ꎬ表明乙酰乳酸合成酶可影响糖分转运ꎻＧａｓｔｏｎ等[５]发现抑制乙酰乳酸合成酶使丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶等的活性有一定的增强ꎬ使生长点组织处于无氧呼吸状态[６]性从而影响植物生长ꎬ表明乙酰乳酸合成酶可以通过影响酶活ꎮ由此可知ꎬＡＬＳ在植物中的重要性ꎮ因其在动物和人体内没有直系同源基因ꎬ故该基因被作为除草剂的一个重要靶点ꎮＡＬＳ的抑制剂类除草剂包括磺酰脲(ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅｓａｓꎬＳＵ)[７]唑啉(ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌｔｈｉｏ￣ｂｅｎｚｏａｔｅｓꎬＰＴＢ)酮(ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｉｎｅｓꎬＩＭＩ)[８]、[９]嘧、啶嘧啶硫代苯(甲ｔｒｉａｚｏｌ￣酸、咪酯ｆｏｎａｍｉｄｙｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓꎬＴＰ)[１０]和磺酰氨基羰基啉酮(ｓｕｌ￣ＡＬＳ动物酶活性的除草剂因其高效ｃａｒｂｏｎｙｌｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅꎬＳＣＴ低毒性而被广泛用于全、球低施药率和对哺乳)[１１]５类ꎮ抑制１９８７各种作物中[１２]ꎮ个由年ＡＬＳꎬ多刺莴苣抑制剂筛选出的含有除草剂抗性的(ＬａｃｔｕｃａｓｅｒｒｉｏｌａＬ.)被鉴定为第一ａｌｓ基因突变的杂草[１３]物在内的１５６种杂草对ꎮ现发现包括ＡＬＳ抑制剂除草剂已经产生双子叶和单子叶植抗性[１４]拟南芥ꎮ

ａｌｓ基因(ＡＴ３Ｇ４８５６０)位于第三染色体上ꎬ其ＣＤｓ序列长度为２０１０ｂｐꎬ编码蛋白含６７０个氨基酸ꎬ由２个大亚基和２个小亚基构成ꎬ大亚基为催化亚基ꎬ小亚基为调节亚基ꎮ当改变ＡＬＳ酶编码序列造成的除草剂靶位点的改变ꎬ可使除草剂靶部位修饰而产生对ＡＬＳ抑制剂的抗性[１５￣１８]中Ｗ５７４Ｓ、产生抗ꎮ据报道ꎬａｌｓＳ６５３Ｆ、性的Ｄ３７６Ｅ、位点包Ｇ６５４Ｄ括Ａ１２２Ｖ、和Ｅ４４６Ｄ

Ｐ１９７Ｓ、Ａ２０５Ｖ、[１９￣２５]

中ꎬａｌｓ中的编码序列改变可以防止或减少与除草剂ꎮ其

的结合ꎬ使其具有抗除草剂功能ꎮ当发生多位点的替换时ꎬ抗性和交叉抗性水平可以因不同的替换而不同[２０]产生抗性ꎮ[２６ꎬ２７]一般性ꎬ而对ＩＭＩ不产生抗性ꎻＰｒｏ１９７来说ꎬＡＬＡ￣１２２￣ＶＡＬ的ꎮ大而以多数对ＳＵ除草剂不Ｔｒｐ￣５７４￣Ｌｅｕ突变对ＳＵ产取代的

生抗性的Ｓ６５３ＦꎬＡｔａｌｓ四个已知突变Ｐ１９７Ｓ、Ｒ１９９Ａ、Ｗ５７４Ｓ和载体ꎬ转化并得到了对咪唑啉酮类和磺酰脲类两种用ＰＣＲ进行体外突变扩增并克隆构建过表达除草剂ꎬ且均具有良好抗性的拟南芥株系ꎮ

１　１.１　材料与方法

本文中所用到的植物材料为拟南芥材料与试剂

Ｃｏｌ￣０ꎮ菌株

包括:ｐＣａｍｂｉａ１３００￣ＧＦＰꎬ大肠杆菌菌株ＤＨ５α和农杆菌菌株ＧＶ１３０１感受态购自南京诺唯赞生物科技有限公司Ｐ１９７Ｓ植株ꎮ阳ꎬ性种子来源于逆境中心毛妍斐博士对照植株１９７为Ａｔａｌｓ碱基编辑后的诺唯赞生物科技有限公司ＰＣＲ反应试剂盒、ＤＮＡꎮ

ꎻ回收试剂盒ＥａｓｙＴａｑ、ＦａｓｔＰｆｕ、均购自南京

、ｐＥＡＳＹ￣ＢｌｕｎｔＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ、ＳｍａＩ和ＸｂａＩ那霉素聚合酶购自(Ｋａｎ)、利福平ＴａＫａＲａꎻＴ４(Ｒｉｆ)和潮霉连接酶素、ＤＮＡ性内切(Ｈｙｇ)Ｍａｒｋｅｒ、酶、Ｔａｑ均购卡自

１.北京全式金生物技术有限公司２　方法

ꎮ

１.２.设计１　ＡｔａｌｓｇａｌｓＲ、ｇ基因突变的设计及全长的获得

ａｌｓＦ引物ꎬ具体序列见表１ꎬ扩增ａｌｓ

基因全长ꎬ标记为:Ｅ￣１９７/１９９/５７４/６５３￣Ｆｌ参照重叠延伸ＰＣＲ的方法[３０]突变ꎬ分别是１９７、１９９、５７４、６５３ꎮꎬ在ａｌｓ基因选择四个位点进行在突变位点附近设计具有突变碱基的引物ꎬ见表１ꎬ送至生工生物有限公司合成引物ꎮ提取野生型拟南芥ＤＮＡꎬ以ＤＮＡ为模板ꎬ进行目的基因的ＰＣＲ扩增ꎬ反应条件为:９４℃预变性３ｍｉｎꎻ９４℃变性３０ｓꎬ５８℃退火３０ｓꎬ７２℃延伸１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２℃延伸５ｍｉｎ至反应结束ꎮ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ回收ＰＣＲ片段１.２.ꎮ

２　突变位点克隆载体的构建

５７４ＧＦＰ以/６５３￣ＦＬ￣ＧＦＰꎬＦꎬａｌｓＥ￣１９７￣ＦＬ￣ＧＦＰ/１９９/即Ｒ５７４进行/６５３￣ＦＬｍ４ＡｔａｌｓＰＣＲ为模板ꎬ引物ａｌｓꎬ用扩增得到ＳｍａＩ、ＸｂａＥ￣１９７Ｉ酶/１９９￣ＦＬ￣

切

/

第６期　　　文素珍等:拟南芥乙酰乳酸合成酶基因(Ａｔａｌｓ)多位点突变以及转基因过表达植株除草剂抗性分析　　　５７３

ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ＧＦＰꎬ并用乙醇沉淀法回收酶切产物ꎮ利用重组的方法构建过表达载体ꎬ体系如下(２０μＬ):ｄｄＨ２Ｏ(１２μＬ)ꎬｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ＧＦＰ酶切产物(１μＬ)ꎬｍ４Ａｔａｌｓ(１μＬ)ꎬ５ｘＣＥＺＺ缓冲液(４μＬ)ꎬＥｘｍａｓｅＩＩ(２μＬ)ꎬ轻轻混匀各组分ꎬ置于ＰＣＲ３７℃反应３０ｍｉｎꎻ反应完成后立即将反应管置于冰水浴中ꎬ冷却５ｍｉｎꎻ将连接产物转化ꎬ筛选阳性

白ꎬ用１２.５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳分离ꎬ湿转法(３００ｍＡꎬ１.５ｈ)将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上ꎮ５％脱脂牛奶加至ＴＢＳ中封闭１ｈꎬ加ＧＦＰ一抗(１∶５０００稀５０００稀释)室温孵育１ｈꎬＥＣＬ化学发光显色ꎮ以等量ａｃｔｉｎ７作为内参ꎬ使用ＩｍａｇｅＪ分析软件ꎬ以目的条带灰度值与ａｃｔｉｎ７条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水平ꎮ

释)ꎬ４℃摇床过夜ꎮＨＲＰ标记的鼠二抗ＩｇＧ(１∶

１.２.３　ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ表达载体转克隆ꎬ测序验证ꎮ

１.２.８　过表达基因拟南芥的抗除草剂分析

化农杆菌

ｍ４Ａｔａｌｓ采￣ＧＦＰ用冻表达载体转化到农杆菌融法ꎬ将构建好的(５０ꎬｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣

含有利福平(５０ｍｇ/Ｌ)和卡那霉素将菌液涂布于ｍｇ/Ｌ)的ＹＥＢ

固体培养基上ꎬ２８℃培养４８ｈꎮ随机挑选出阳性菌落ꎬ送至生工生物(上海)有限公司进行菌液测序ꎮ测序结果与数据库进行比对ꎬ将比对正确的农杆菌菌液加入１.２.５０％无菌甘油ꎬ－８０℃保存ꎮ

将４　－农杆菌８０℃保存的ＧＶ３１０１ＧＶ３１０１转染野生型拟南芥

农杆菌二次活化ꎬ重

悬至ＯＤ的拟南芥为转染对象６００ｎｍ≈０.８时作为转染液ꎬ用重悬好的转染液浸染野生ꎮ以生长约３０ｄ型拟南芥花序约９０ｓꎬ盖上黑色塑料罩ꎬ平放在避光环境中保湿约１.２.５　抗性苗的筛选

２４ｈ后ꎬ正常培养至种子成熟ꎮ

收获转化的拟南芥Ｔ１代种子ꎮ将种子均匀播

种到含潮霉素(５０ｍｇ/Ｌ)的１/２ＭＳ培养基上培养ꎮ选取阳性拟南芥植株ꎬ移栽到营养土中培养ꎬ收获成熟的１.Ｔ２代种子ꎮ用不同浓度的除草剂筛选达植株

２.６　ＬｅｉｃａＭ２０５ＦＡ荧光体式显微镜观察过表ꎮ

Ｍ２０５ＦＡ将生长１０ｄ的Ｔ２代拟南芥小苗ꎬ放置于Ｌｅｉｃａ

根据需要打开荧光体式显微镜观察ꎬ左侧面前端拨杆调整明暗场变化ꎮ先开电源再开软件ꎬ调ꎬ焦支架黑色旋钮调焦ꎬ然后选择合适变被比ꎬ白色转轮可拨挡变倍ꎮ荧光先打开ＥＬ６０００ꎬ在体式镜的荧光光路有个开关打开照明光路ꎬ调整体式荧光转盘拨到１.２.ＧＦＰ位置ꎬ观察植株发光情况ꎮ

以拟南芥７　蛋白提取(Ｃｏｌ￣０)ꎬ分离及蛋白质印迹分析

及ａｌｓ过表达植株的叶片为材

料ꎬ称取８０ｍｇ材料ꎬ液氮破碎ꎬ加入裂解液和蛋白酶抑制剂按１００∶１比例加至所取组织中ꎬ收集上清ꎻ１０一部ｍｉｎꎻ分另一部分加入ｌｏａｄｉｎｇ８０℃ｂｕｆｆｅｒ保存ꎮ蛋每泳道上样白变性ꎬ９５２５℃μＬ煮蛋沸

＃４８ꎬ＃５４ꎬ＃７２将经潮霉素筛选得到的Ｔ２代种子(＃３ꎬ＃２１ꎬ

((ｔｒｉｂｅｎｕｒｏｎ￣ｍｅｔｈｙｌꎬ)播种ＴＲＭＥ于含有)和不同甲浓度苯磺隆除草剂行检测ｉｍａｚａｍｏｘ)ꎮ

的１/２ＭＳ培养基上ꎬ氧对其除草剂抗性进咪草烟除草剂表１　引物序列Ｔａｂ.１　Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

ＰｒｉｍｅｒｇＰｒｉｍｅｒｇａｌｓＲｎａｍｅＴＣＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′－３′)

Ｄ１９７ａｌｓＦ/１９９ＦＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＭ１９７ＲＤ１９７/１９９Ｒ

ＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＭ１９７ＦＧＣＡＣＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＣＡＡＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＧＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧ

Ｍ１９９ＦＭ１９９ＲＴＣＡＴＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＡ

Ｍ１９７＋１９９ＦＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＴＤ５７４Ｍ１９７/６５３Ｆ＋１９９Ｒ

ＣＴＣＴＣＧＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＴＭ５７４ＦＤ５７４/６５３ＲＴＡＴＧＣＧＡＴＴＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＡＧＣＡＣＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＡＴＣＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣ

ＡＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＭ６５３ＦＭ５７４ＲＡＴＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＡＴＭ６５３ＲＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＡＡＡＣＧＧＧＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＡＣＡＣＡＴａｌｓ￣ＦＬ￣ＧＦＰＦＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧ￣

ＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ

ａｌｓ￣ＦＬ￣ＧＦＰＲＧＧＴＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＴ￣ＴＡＡＴＣＣＧＧＣＣＡＴＣＴＣ

２　２.１　结果与分析

将野生型拟南芥ａｌｓ基因全长与突变基因的克隆

(Ｃｏｌ￣０)的基因组ＤＮＡ作为模

板ꎬ进行ＰＣＲ扩增ꎮ结果表明ꎬ条带大小与预期目的基因片段大小一致ꎬ约２０００ｂｐ(见图１)ꎬ进一步测序验证Ａｔａｌｓ基因全长序列正确ꎮ利用重叠延伸ＰＣＲ技术ꎬ获得不同位点突变的片段并电泳ꎬ如图２ꎮ

　５７　４　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　

ＰＣＲ产物测序验证如图３ꎮ突变ＣＤｓ序列第５８９位５９５位由Ｃ变成Ｇ和５９６位由Ｇ变成Ｃꎬ使蛋白第Ｃ为Ｔꎬ蛋白第１９７位氨基酸由Ｐ转变为Ｓꎻ突变第１９９位氨基酸由Ｒ变为Ａꎻ突变第１７２１位由Ｇ变成Ｔꎬ蛋白第５７４位氨基酸由Ｗ转变为Ｌꎻ突变第１９５７位由Ａ变成Ｔ和第１９５８位由Ｇ变成Ｔꎬ使蛋白第６５３位氨基酸由Ｍ变为Ｆꎮ

第２８卷

图１　ａｌｓ基因全长扩增

Ｆｉｇ.１　Ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｓｇｅｎｅ

泳道Ｍ为ＤＮＡ分子量标准ꎻ泳道１为目的片段ꎬ大小约２０００ｂｐ

ＬａｎｅＭｉｓＤＮＡｍａｒｋｅｒｔａｒｇｅｔꎻａｌｓｌａｎｅｆｒａｇｍｅｎｔ

１ｉｓｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ

图２　Ａｔａｌｓ不同位点突变的片段电泳图Ｆｉｇ.２　ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＡｔａｌｓｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ

Ｍ为ＤＮＡ５７４分子量标准、６５３、５７４￣６５３ꎻＷＴ分别表示不同突变片段

为野生型组ꎻ１９７、１９９、１９７￣１９９、

Ｍｉｓ１９７￣１９９ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎬꎻＷＴｉｓｗｉｌｄｔｙｐｅｇｒｏｕｐꎻ１９７ꎬ１９９ꎬ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ５７４ꎬ６５３ｍｕｔａｔｉｏｎꎬ５７４￣６５３ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ａｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ

２.鉴定

２　过表达ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ的拟南芥植株的筛选与植株果荚成熟后收取所有种子ꎮ将种子播种在

图３　Ａｔａｌｓ不同位点突变的测序结果

Ｆｉｇ.３　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆＡｔａｌｓｍｕｔａｔｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｉｔｅｓ

含有潮霉素抗性的１/２ＭＳ培养基上ꎬ生长约１０ｄ后长出很绿的小苗可能就是转基因苗(如图４)ꎬ将有根ꎬ叶子颜色嫩绿的小苗ꎬ移至土壤中进行培养ꎬ收取Ｔ１代种子ꎮ

图４　潮霉素抗性筛选ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ转基因苗Ｆｉｇ.４　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｆｍ４Ａｔａｌｓｔｏｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ

￣ＧＦＰｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇｓ

转基因Ｔ１代种子在含有潮霉素的培养基上筛选ꎻ红色箭头处表示阳性苗

ＴａｎｓｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍＴ１ꎻｐｌａｎｔｓｔｈｅｒｅｄｗｅｒｅａｒｒｏｗｓｃｒｅｅｎｅｄｓｈｏｗｅｄｏｎｔｈｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｅｄｌｉｎｇ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ＢＩＡ１３００　　为增加阳性苗的筛选效率ꎬ我们在ｐＣＡＭ￣

图ｍ４于拟南芥Ａｔａｌｓ５ꎮ由质粒中插入了￣ＧＦＰＬｅｉｃａ转基因过表达植株Ｍ２０５ＦＡＧＦＰ荧绿色荧光筛选标记光ꎬ体ꎬ如发现式显ＧＦＰ微荧光分布镜观察ｍ４Ａｔａｌｓ的叶ꎬ茎ꎬ根等部位如图６ꎬ结果初步表明ｗｅｓｔｅｒｎ为进￣ＧＦＰ一步已表达验证ꎮ

其蛋白表达水平ꎬ我们进行了

表明ꎬ在ｂｌｏｔ过表分析达ꎮ株如图系(７所示ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验结果５０ｍ４ＡｔａｌｓｋＤꎬ￣ＧＦＰ大于蛋ＧＦＰ白接头蛋白本身的分子量均有表＃３ꎬ达＃２１ꎬꎬ蛋白＃４８ꎬ分子＃５７ꎬ量ꎬ大＃７２而在野生小)约中为

ꎬ

第６期　　　文素珍等:拟南芥乙酰乳酸合成酶基因(Ａｔａｌｓ)多位点突变以及转基因过表达植株除草剂抗性分析　　　５７５

图５　ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ重组载体示意图Ｆｉｇ.５　ＳｃｈｅｍａｔｉｃＧＦＰｄｉａｇｒａｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｍ４ｖｅｃｔｏｒ

Ａｔａｌｓ￣

图６　ＬｅｉｃａＭ２０５ＦＡ荧光体式显微镜观察ｍ４Ａｔａｌｓ￣Ｆｉｇ.６　ＧＦＰ过表达植株

ｂｙＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎＬｅｉｃａＭ２０５ＦＡｏｆｍ４Ａｔａｌｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ￣ＧＦＰｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｐｌａｎｔｓ

(ａ)叶ꎻ(ｂ)下胚轴ꎻ(ｃ)根毛ꎻ(ｄ)茎(ａ)Ｌｅａｆꎻ(ｂ)Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓꎻ(ｃ)Ｒｏｏｔｈａｉｒꎻ(ｄ)Ｓｔｅｍ

ａｇｅＪ型株系中未检测到ＧＦＰ信号ꎮ同时本研究利用Ｉｍ￣

蛋白灰度分析蛋白电泳条带灰度比)ꎬ其中＃３ꎬ＃２１ꎬ＃４８ꎬ＃５７ꎬ＃７２(目的蛋白灰度的灰度比分/内参别为２.３　:０.６９３３ꎬ１.１２８９ꎬ０.４６６８ꎬ０.６９４２ꎬ０.４５２２ꎮ

经潮霉素筛选得到的过表达基因拟南芥的抗除草剂分析

Ｔ１代转基因植株种植后

收集＃７２)除草剂抗性的检测为试验材料进行磺酰脲类除草剂和咪唑啉酮类Ｔ２代种子ꎬ并以Ｔ２代种子(＃３ꎬ＃２１ꎬ＃４８ꎬ＃５４ꎬꎮ首先配制不同浓度的除草剂培养基ꎬ其中ꎬ苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的浓度分别为２.５ｍｇ/Ｌ和５ｍｇ/Ｌꎮ过表达基因拟南芥植株(＃３ꎬ＃２１ꎬ＃４８ꎬ＃５４ꎬ＃７２)在含有苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的培养基上生长１２ｄ观察其表型ꎬ结果表明在含有浓度５ｍｇ/Ｌ的苯磺隆除草剂的

图７　蛋白质免疫印迹检测ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ蛋白表达Ｆｉｇ.７　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

３、２１、ＧＦＰ４８、５７表示、７２ＧＦＰ为转基因株系信号ꎻＡＣＴＩＮꎻＣｏｌ￣０表示内参

为野生型ꎻ３ꎬ２１ꎬＧＦＰ４８ꎬ５７ｉｓＧＦＰꎬ７２ｓｉｇｎａｌａｒｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃꎻＡｃｔｉｎｉｓｌｉｎｅｓｉｎｔｅｒｎａｌꎻＣｏｌ￣０ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｉｓｗｉｌｄｔｙｐｅꎻ

培养基中阳性植株Ｔ２１９７长势良好ꎬ而我们的转基因草剂性状分离代植物也表现出一定的抗除草性ꎮ在含有浓度为２.５ꎬｍｇ并且出现抗除/Ｌ的甲氧咪草烟培养基上ꎬ１９７和Ｃｏｌ￣０均没有表现抗性ꎬ我们的转基因植株长势也很缓慢ꎬ但与对照相比较ꎬ长出较小的绿色叶片ꎬ表现出较弱的抗性(图８)ꎮ

图８　ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ转基因植株在培养基上萌发时

的除草剂抗性

Ｆｉｇ.８　Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

ｐｌａｎｔｓｄｕｒｉｎｇｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｎｍｅｄｉｕｍ

野生型Ｃｏｌ￣０ꎬ阳性对照１９７ꎬ转基因株系＃３、＃２１、＃４８、＃５７和＃７２播种在不同浓度的除草剂培养基中萌发观察抗性表型Ｗｉｌｄｔｙｐｅ＃２１ꎬＣｏｌ￣０＃４８ꎬꎬｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ１９７ａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅ＃３ꎬ

ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ＃５７ａｎｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ＃７２ｗｅｒｅｓｏｗｅｄｍｅｄｉｕｍ

ｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

　抗性　为了进一步确定转基因植株是否获得了除草剂ꎬ我们将过表达植株和野生型拟南芥Ｃｏｌ￣０种植于土壤中ꎬ对野生型拟南芥植株和ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ转基因过表达植株喷施(Ｔｒｍｅ２５ｍｇ/Ｌ＋Ｉｍａｚａｍｏｘ２５ｍｇ/Ｌ)１０除草剂以确定其是否获得了抗除草剂的抗性ｄ后ꎬ野生型拟南芥植株的叶子开始变紫ꎬ而ｍ４ꎮＡｔａｌｓ喷施

ＧＦＰ转基因过表达的＃４８株系植株表现正常￣２０ｄ后ꎬ野生型植株枯萎死亡ꎬ而ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰꎬ见图转基９ꎮ　５７　６　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　

因过表达植株表现出对苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的双重耐受性ꎬ继续正常生长ꎮ

第２８卷

水稻和野生型水稻ꎬ结果显示野生型叶片黄化、植株ａｍｉ等[３４]在皱匕果中发现靶标和非靶标抗性机制都和其对苯磺隆的抗性有关ꎮ２０１８年ꎬ许勇研究团队[３５]利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９单碱基编辑技术在西瓜内源ａｌｓ基因上引入了单碱基突变ꎬ使１９０位的Ｐｒｏ被Ｓｅｒ替换ꎬ创制出全球首个基因编辑抗除草剂(苯磺２０５￣Ｖａｌ位点的突变产生了除草剂抗性ꎮ刘伟唐等[３７]在牛繁缕研究中发现Ｐｒｏ￣１９７￣Ｇｌｕ位点突变对ＳＵ、ＴＰ、ＰＴＢ、ＳＣＴ和ＩＭＩ产生交叉抗性ꎮ

本研究通过重叠延伸ＰＣＲ技术体外突变扩增四隆)的西瓜ꎮ黄兆峰等[３６]在反枝苋研究发现Ａｌａ￣矮小萎蔫十分严重ꎬ而经编辑的株系生长正常ꎮＨａｔ￣

个已知位点突变的Ｐ１９７Ｓ/Ｒ１９９Ａ/Ｗ５７４Ｓ/Ｓ６５３Ｆ拟南芥Ａｔａｌｓꎬ克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ＧＦＰ载体上ꎬ从而构建了四个位点突变的ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ融合蛋白过表达载体ꎮ并且转基因株系中ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ蛋白表达

图９　ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ转基因＃４８株系植株在土壤中

对除草剂喷施的抗性表型

Ｆｉｇ.９Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｌｉｎｅ＃４８ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

ｐｌａｎｔｓｔｏｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｓｐｒａｙｉｎｇ

(ａ)喷施除草剂之前ꎻ(ｂ)喷施Ｔｒｍｅ２５ｍｇ/Ｌ＋Ｉｍａｚａｍｏｘ２５ｍｇ/Ｌ之后１０ｄ＃４８与野生型对照植株比较表现

出明显的除草剂抗性

(ａ)Ｔｈｅｐｌａｎｔｇｒｏｗｉｎｇｓｔａｔｕｓｂｅｆｏｒｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｓｐｒａｙꎻ

１)ｂ(０ｄａｙｓａｆｔｅｒｓｐｒａｙｉｎｇＴｒｍｅ２５ｍｇ/Ｌ＋Ｉｍａｚａｍｏｘ２５ｍｇ/Ｌꎬ＃４８ｌｉｎｅｓｈｏｗｅｄ

ｏｂｖｉｏｕｓｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｌ￣０

通过荧光观察和免疫印迹分析鉴定已经成功表达ꎮ对转基因拟南芥在不同浓度梯度除草剂添加的培养基上进行种子萌发测试ꎬ观察拟南芥长势ꎬ发现在苯磺隆除草剂浓度为５ｍｇ/Ｌ培养下的苗长势较好ꎬ表２.５ｍｇ/Ｌ时ꎬ与对照植株相比表现出较弱的抗性ꎮ在喷施除草剂(Ｔｒｍｅ２５ｍｇ/Ｌ＋Ｉｍａｚａｍｏｘ２５ｍｇ/Ｌ)的试验中ꎬ与对照相比ｍ４Ａｔａｌｓ￣ＧＦＰ转基因过表达＃４８号株系植株表现出对苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的明显耐受性ꎮ在喷施除草剂的试验中ꎬ其他转基因过表达株系也有一定的除草剂抗性ꎬ但是因所选小苗来自除草剂抗性鉴定后的阳性植株ꎬ其生长状态受到极大的影响ꎬ在后续试验中我们将获得相应的纯合转基因株系进行除草剂抗性测定ꎮ

我们的研究通过ａｌｓ基因多位点组合突变ꎬ整合转基因植物对不同除草剂的抗性做出了摸索ꎬ为改造ａｌｓ基因结构和提高转基因植物耐除草剂能力提供了有力依据和基础ꎮ

现出较明显的抗除草性ꎮ在除草剂ＴＲＭＥ浓度为

３　讨论

ａｌｓ基因的一个或者几个碱基发生突变可使其编

码的ａｌｓ中相应的氨基酸发生改变ꎬ可能会导致杂草会对ＡＬＳ抑制剂产生抗药性ꎬ同时ａｌｓ基因的过量表达也会导致杂草对ＡＬＳ抑制剂产生抗药性ꎮ

已有报道表明拟南芥ＣＤｓ序列１８８１位Ｇ碱基变成Ａ碱基ꎬ产生咪唑啉酮类除草剂抗性ꎬ当除草剂浓度为０.１ｍｇ/Ｌꎬ处理４ｄ时野生型与转基因株系幼苗表现出差异ꎬ最终野生型幼苗白化致死ꎬ转基因幼苗仍保持绿色正常生长[３１]ꎮＳｈｉｍａｔａｎｉ等[３２]将水０.０７ｍｇ/Ｌ甲氧咪草烟处理条件下相对野生型就已表现出明显的生长优势ꎮＳｕｎ等[３３]以Ｃａｓ９技术对水稻ａｌｓ基因进行突变处理ꎬ分别将５４８位(杂草中为５７４位)Ｔｒｐ和６２７位(杂草中为６５３位)Ｓｅｒ替换为Ｌｅｒ和Ｉｌｅꎬ培育出了抗双草醚的基因编辑水稻ꎮ使用１００μｍｏｌ/Ｌ的双草醚喷洒处理五叶期基因编辑稻中９６位(杂草中为１２２位)Ａｌａ替换为Ｖａｌꎬ并在

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[４]　ＲＯＹＵＥＬＡＭꎬＧＯＮＺＡＬＥＺＥＭꎬꎬＧＯＮＺＡＬＥＺＡꎬｅｔａｌ.Ｐｈｙｓｉ￣

ｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｕｂｌｅｔｈａｌｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒｓｕｐｐｌｙｔｏｐｅａｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ１５７(３):３４５￣３５４.[５]　ＧＡＳＴＯＮＳꎬＺＡＢＡＬＺＡＡꎬＧＯＮＺＡＬＥＺＥＭꎬｅｔａｌ.Ｉｍａｚｅｔｈａ￣

ｐｙｒꎬａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｂｒａｎｃｈｅｄ￣ｃｈａｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬｉｎｄｕｃｅｓａｅｒｏｂｉｃｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｐｅａｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎ￣ｔａｒｕｍꎬ２０１０ꎬ１１４(４):５２４￣５３２.

ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬ１９９０ꎬ９(１￣４):２２７￣２３２.

[２２]　ＷＡＲＷＩＣＫＳＩꎬＸＵＲꎬＳＡＵＤＥＲＣꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎ￣

ｔｈａｓｅｔａｒｇｅｔ￣ｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｉｎＡＬＳ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｋｏｃｈｉａ(Ｋｏｃｈｉａｓｃｏｐａｒｉａ)[Ｊ].ＷｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００８ꎬ５６(６):７９７￣８０６.

ｔｈｕｓｐｏｗｅｌｌｉｉ[Ｊ].ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ９５(１):３８￣４６.

[６]　ＺＡＢＡＬＺＡＡꎬＧＯＮＺＡＬＥＺＥＭꎬＡＲＲＥＳＥ￣ＩＧＯＲＣꎬｅｔａｌ.Ｆｅｒ￣

ｍｅｎｔａｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅｂｒａｎｃｈｅｄ￣ｃｈａｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｉｎｐｅａ[２３]　ＷＨＡＬＥＹＣＭꎬＷＥＳＴＷＯＯＤＷＪＨ.ＡＮｅｗｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔ

ＡＬＳＣｏｎｆｅｒｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｆｉｖｅｃｌａｓｓｅｓｏｆＡＬＳ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｈｅｒｂｉ￣ｃｉｄｅｓ[Ｊ].ＷｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ５５(２):８３￣９０.

[２４]　ＬＡＰＬＡＮＴＥＪꎬＲＡＪＣＡＮＩꎬＴＡＲＤＩＦＦＪ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅａｌｌｅｌｉｃｆｏｒｍｓ

ｏｆａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅａｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｃｅｉｎＳｅｔａｒｉａｖｉｒｉｄｉｓ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＆ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００５ꎬ　５３(１９)ＣＨＡＬＥＦＦ:７４８６￣７４９３.ｏｆａｃｔｉｏｎＲＳꎬＭＡＵＶＡＩＳＣＪ.Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｓｔｈｅｓｉｔｅ

　ｅｎｃｅꎬＳＨＡＮＥＲ１９８４ꎬｏｆｔｗｏ２２４(４６５６)ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ:ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｓｃｉ￣ｉｔｏｒｓｏｆａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄＤＬꎬＳＴＩＤＨＡＭＡ１４４３￣１４４５.ＭＡ.Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ:ｐｏｔｅｎｔｉｎｈｉｂ￣

　７６(２)ｓｙｎｔｈａｓｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９８４ꎬＳＴＩＤＨＡＭ:５４５￣５４６.ＭＡ.Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ　ｔｈａｓｅ[ＧＥＲＷＩＣＫＪ].ＷｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ１９９１ꎬｔｈａｔ３９(３)ｉｎｈｉｂｉｔ:ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ４２８￣４３４.

ｓｙｎ￣

Ｉꎬｒｉｍｉｄｉｎｅｓ[ｅｔａｌ.ＭｅｃｈａｎｉｓｍＪ].ＢＣꎬＰｅｓｔＳＵＢＲＡＭＡＮＩＡＮＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅꎬＭ１ꎬ２ꎬ４￣ｔｒｉａｚｏｌｏ[１ꎬ５￣ａ]ＶꎬＬＯＮＥＹ￣ＧＡＬＬＡＮＴ１９９０ꎬ２９(３):３５７￣ｐｙ￣Ｖ

１１]　３６４.ＳＡＮＴＥＬｒｂａｚｏｎｅ￣ｓｏｄｉｕｍ￣ａｏａｔａｎｄＨＪꎬＢＯＷＤＥＮｎｅｗｈｅｒｂｉｃｉｄｅＢＡꎬＳＯＲＥＮＳＥＮｆｏｒｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅＶＭꎬｃｏｎｔｒｏｌｅｔａｌ.ｏｆＦｌｕｃａ￣

ｗｉｌｄ　ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｇｒｅｅｎＭＡＺＵＲＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅꎬｆｏｘｔａｉｌｉｎ１９９９.

ｗｈｅａｔ[Ｃ].Ｂｒｉｇｈｔｏｎ:ＢｒｉｇｈｔｏｎＣｒｏｐｓｉｓｔａｎｔｃｒｏｐｓＢＪꎬＦＡＬＣＯＳＣ.Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅ￣

　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴＨＩＬＬＢｉｏｌｏｇｙꎬ[Ｊ].Ａｎｎｕａｌ２００３ꎬ４０(１)ＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌａｎｄＰｌａｎｔｐｒｉｃｋｌｙＤｌｅｔｔｕｃｅＣ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ:４４１￣４７０.(Ｌａｃｔｕｃａｓｅｒｒｉｏｌａｏｆｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ)[Ｊ].Ｗｅｅｄｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

　１９９０ꎬＨＥＡＰ４(１):１６３￣１６８.Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ　ＷｅｅｄＹＵＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＩ.Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ１９９０ꎬｓｕｒｖｅｙ４(１)ｏｆ:ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ２２０￣２２０.

ｒｅｓｉｓｔａｎｔｗｅｅｄｓ[Ｊ].

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＱꎬＡＢＤＡＬＬＡＨｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｅｎｄｏｗｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＩꎬｉｎＨＡＮｍｕｌｔｉｐｌｅＨꎬｔｏｇｌｙｐｈｏｓａｔｅꎬｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｔａｌ.ＤｉｓｔｉｎｃｔＡＣＣａｓｅｎｏｎ￣ｔａｒｇｅｔａｎｄＡＬＳ￣ｓｉｔｅ

　ｄｕｍ[ＹＵｃｒｏｓｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｙａｎｄＱꎬＪ].ｇｌｏｂａｌＰＯＷＬＥＳＰｌａｎｔａꎬ２００９ꎬ２３０(４):７１３￣７２３.ｌｏｌｉｕｍｒｉｇｉ￣ｃｒｏｐｉｎＳ.ｃｒｏｐｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ￣ｂａｓｅｄｗｅｅｄｓ:ａ[ｔｈｒｅａｔＪ].ＰｌａｎｔｔｏｈｅｒｂｉｃｉｄｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉ￣２０１４ꎬａｎｄ

　１６６(３)ＰＯＷＬＥＳ:１１０６￣１１１８.

ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ[ＳＪ].ＢꎬＹＵＡｎｎｕａｌＱ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎＲｅｖｉｅｗｉｎａｃｔｉｏｎ:ｐｌａｎｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏ

　(１)ｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ６１ＶＥＬＤＨＵＩＳ:３１７￣３４７.

ｔａｂｏｌｉｓｍ￣ｂａｓｅｄＬ.)ｂｉｏｔｙｐｅＬｔｏＪꎬｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｅｔｈａｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ￣ｍｅｔｈｙｌ[ＨＡＬＬＬｏｆＭꎬａＯ’ｗｉｌｄＤＯＮＯＶＡＮｍｕｓｔａｒｄＪ].Ｊｏｕｒｎａｌ(ＪＳｉｎａｐｉｓＴꎬｅｔｏｆａｌａｒｖｅｎｓｉｓ.Ｍｅ￣

　ｔｕｒａｌＢＯＵＴＳＡＬＩＳ＆ＦｏｏｄｏｆｓｙｍｂｒｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｒｉｅｎｔａｌｅｔｏＰꎬＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅＫＡＲＯＴＡＭ２０００ꎬａｎｄｂｒａｓｓｉｃａｓｙｎｔｈａｓｅ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＪꎬＰＯＷＬＥＳ４８(７):２９８６￣２９９０.

Ａｇｒｉｃｕｌ￣ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ[ＳＢ.Ｊ].ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｅｓｔｉｃｉｄｅｉｎｂａｓｉｓ

ｓｉ￣　ｅｎｃｅꎬＴＲＡＮＥＬ１９９９ꎬ５５(５):５０７￣５１６.Ｓｃｉ￣ｈｉｂｉｔｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ:ｗｈａｔＰＪꎬＷＲＩＧＨＴＴＲ.ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｗｅｅｄｓｔｏＡＬＳ￣ｉｎ￣

　２００２ꎬｈａｖｅｗｅｌｅａｒｎｅｄ[Ｊ].ＷｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬＡＳＨＩＧＨ５０(６)ｉｚａｔｉｏｎｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＪꎬＣＯＲＢＥＴＴ:７００￣７１２.ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｄｕｅｔｏｔｅｓｔｓＣａｎＡＡｓｐ３７６ＧｌｕＬꎬｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＳＭＩＴＨＰｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎＪꎬｔｏｅｔａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄａｌ.ｉｎＣｈａｒａｃｔｅｒ￣

ａｍａｒａｎ￣

[２５]　２００９ꎬＭＡＳＳＡ１１９(４)ｔｏｃｏｎｆｅｒｒｅｄＡＬＳ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＤꎬｂｙＫＲＥＮＺ:５７７￣５８５.ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓＢꎬＧＥＲＨＡＲＤＳａｎｄｉｎａｐｅｒａｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｓｐｉｃａ￣ｖｅｎｔｉＲ.Ｔａｒｇｅｔ￣ｓｉｔｅｕｎｋｎｏｗｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

ｉｓ[２６]　[ＹＵＪ].ｃｉｄｅｓ:ＱꎬＷｅｅｄｃｕｒｒｅｎｔＰＯＷＬＥＳＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１１ꎬ５１(３):２９４￣３０３.ｍｕｔａｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇＳＢ.Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ[Ｊ].ＰｅｓｔｔｏＡＨＡＳＭａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉ￣

[２７]　２０１４ꎬＳＩＥＨＬ７０(９)ｔｅｒｎｓｓｙｎｔｈａｓｅｏｆＤｃｒｏｓｓ￣ｔｏｌｅｒａｎｃｅＬꎬＢＥＮＧＴＳＯＮ:１３４０￣１３５０.

ＳｃｉｅｎｃｅꎬｔｏｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓＡＳꎬＢＲＯＣＫＭＡＮｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄＪＰꎬｅｔａｌ.Ｐａｔ￣

[２８]　ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ[ｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌＦＯＥＳａｒｉａ)ｂｉｏｔｙｐｅＭＪꎬＬＩＵＪ].ｒｅｓｉｓｔａｎｔＬＸꎬＣｒｏｐｃｏｒｎＶＩＧＵＥＳｃｉｅｎｃｅꎬｈｙｂｒｉｄｓｔｏｔｒｉａｚｉｎｅＧꎬａｎｄｅｔ１９９６ꎬｄｅｓｉｇｎｅｄａｌ.３６(２)ｆｏｒ:ｔｏｌｅｒａｎｃｅ２７４￣２７８.

ｔｏＡＬＳ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＡｋｏｃｈｉａ(Ｋｏｃｈｉａｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｓｃｏｐ￣

[２９]　[ＳＩＢＯＮＹＪ].ＷｅｅｄｔｏａｍａｒａｎｔｈｕｓａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅＭꎬＳｃｉｅｎｃｅꎬｂｌｉｔｏｉｄｅｓ(ＲＵＢＩＮｓｙｎｔｈａｓｅ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＢ.１９９９ꎬＭｏｌｅｃｕｌａｒ４７(１)ｂａｓｉｓ:２０￣２７.ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｄａｔｒａｚｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

ｉｎ[３０]　２１６(６)ｐｒｏｓｔｒａｔｅｐｉｇｗｅｅｄ)[Ｊ].Ｐｌａｎｔａꎬ２００３ꎬＳＨＥＶＣＨＵＫ:１０２２￣１０２７.ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓｉｏｎＮＡꎬＢＲＹＫＳＩＮ[３１]　ｓｅａｒｃｈꎬｏｆｓｅｖｅｒａｌ刘菲２００４ꎬｏｆｆｒａｇｍｅｎｔｓｌｏｎｇＤＮＡｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ[ｍｏｌｅｃｕｌｅｓＡＶꎬＮＵＳＩＮＯＶＩＣＨｕｓｉｎｇＪ].ｌｏｎｇＮｕｃｌｅｉｃＰＣＲ￣ｂａｓｅｄＹＡｃｉｄｓＡꎬｅｔＲｅ￣ａｌｆｕ￣.

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ｇｅｎｅａｎｄ[３２]　ＡＬＳｖｅｃｔｏｒＳＨＩＭＡＴＡＮＩＧｅｎｅｉｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＲｉｃｅ[ｃｏ￣ｅｄｉｔｅｄｔｉｏｎｓｉｎｒｉｃｅｇｅｎｅｓ[ＺꎬＪ].ｂｙＦＵＪＩＫＵＲＡＤ].ａｎｄＴｉａｎｊｉｎ:Ｎａｎｋａｉｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｅｘｐｒｅｓ￣ＣＲＩＳＰＲ￣ｂａｓｅｄＵꎬＩＳＨＩＩｔａｒｇｅｔｅｄＨꎬＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬｅｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｌ.Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ２０１４

ｓｕｂｓｔｉｔｕ￣ｏｆ

[３３]　１３１(１)ＳＵＮｓｉｓｔａｎｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＹꎬ:ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１８ꎬＺＨＡＮＧ７８￣８３.

Ｘꎬ[３４]　Ｐｌａｎｔꎬｒｉｃｅ２０１６ꎬｐｌａｎｔｓ９(４)ｏｆｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＷＵＣꎬ:６２８￣６３１.ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅＣＲＩＳＰＲｅｔａｌ./Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｙｎｔｈａｓｅ[Ｊ].ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓＭｏｌｅｃｕｌａｒｒｅ￣

ＭｕｌｔｉｐｌｅＨＡＴＡＭＩＺＭꎬＪＡＶＩＤＧꎬＲＯＪＡＮＯ￣ＤＥＬＧＡＤＯＡＭꎬｅｔａｌ.

ｒｕｇｏｓｕｍｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｏＡＬＳｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ[ｉｎｃｒｅａｓｅＪ].ｌｅｖｅｌｓＦｒｏｎｔｉｅｒｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＰｌａｎｔｉｎＲａｐｉｓｔｒｕｍ[３５]　２０１６ꎬＴＩＡＮｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ７:Ｗꎬ１６９.

ＳｃｉｅｎｃｅꎬｗａｔｅｒｍｅｌｏｎＪＩＡＮＧＬＪꎬｖａｒｉｅｔｙＣＵＩＸｔｈｒｏｕｇｈＸꎬｅｔａｌＣＲＩＳＰＲ.Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣

[３６]　ｂａｓｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇ[Ｊ].ＨＵＡＮＧｓｉｓｔｈｕｓｆｏｒｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＺＦꎬＣＨＥＮＰｌａｎｔＬ.ｔｏ)[ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒＪＣｅｌｌＹꎬＲｅｐｏｒｔｓꎬＺＨＡＮＧ２０１８ꎬ３７(９):１３５３￣１３５６.Ｊ].ＰｅｓｔｉｃｉｄｅｉｎｒｅｄｒｏｏｔＣＸꎬｅｔａｌ.Ｔａｒｇｅｔ￣ｓｉｔｅｂａ￣

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｍａｒａｎｔｈａｎｄ(Ｐｈｙｓｉｏｌｏ￣Ａｍａｒａｎ￣[３７]　ｇｙꎬＬＩＵ２０１６ꎬｓｔｉｔｕｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＷＴꎬ１２８:ＹＵＡＮ１０￣１５.

ＧＨꎬＤＵＬꎬａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬｉｎａｃｒｏｓｓａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ２０１５ꎬＡＬＳｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｅｔ１１７:３１￣３８.

([ＡＬＳ)ａｌＪ]..ＡｃｏｎｆｅｒｓＰｅｓｔｉｃｉｄｅｎｏｖｅｌＰｒｏ１９７Ｇｌｕｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｕｂ￣

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