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中国兽医学报 2006年3月 第26卷 第2期 ChinJVetSci Mar.2006 Vol.26 No.2
禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立
耿士忠1,曾显营1,2,潘志明1,黄金林1,焦新安1,23,刘秀梵2 (1.扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州225009;
2.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏扬州225009)
摘要:根据禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)和血凝素(HA)基因序列,设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物(NP2F,NP2R)和2对用来鉴定AIVH5和H9不同亚型特异性引物(H52F,H52R;H92F,H92R),建立了多重RT2PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带,分别为型(NP:330bp)和亚型(H5A:550bp,或H9A:490bp)。通过对105份样品进行检测,并与病毒分离及琼脂扩散(AGP)血清学方法作平行对比,两者之间符合率达100%;试验灵敏度为102ELD50。结果表明,建立的多重RT2PCR为检测H5、经济、易行的技术。H9亚型AIV提供了一种快速、关键词:禽流感病毒;核蛋白基因;血凝素基因;多重RT2PCR
中图分类号:S852165 文献标识码:A 文章编号:100524545(2006)0220160202 禽流感(Avianinfluenza,AI)是由正粘病毒科流感病毒属的A型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的禽类烈性传染病,其中高致病性AIV还可以感染人,被OIE列为A类动物传染病。AI的诊断,包括病原的分离鉴定、琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验、免疫荧光法和ELISA等常规方法发挥了重要作用,但这些方法操作比较繁琐,费时、费力。分子生物学的发展为快速而准确地对AIV检测和分型鉴定创造了条件,如RT2PCR及核酸探针等检测技术,但它们主要针对单基因检测,常需要进行多次试验才能定型。而多重RT2PCR方法,以多对引物在同一PCR反应体系中扩增出同一病毒不同的特异性基因序列,既简化了操作步骤,又能快速定型
[1,2]
后收集死亡鸡胚的尿囊液,并测定其血凝价和对SPF鸡胚的半数致死量。
114 病毒RNA的提取 按照Trizolkit说明书提取AIVRNA,用DEPC处理的水溶解。115 RT-PCR
11511 病毒RNA的反转录(RT) 参照文献[1,2,7,8],并
加以改良。2ΛLRNA和3ΛL3种引物混合物(NP2F,H5A2F,H9A2F,各20pmmolL)70℃作用5min后,冰浴5min;然后分别加入5×RT2buffer4ΛL,dNTP(2.5ΛmolL)4ΛL,RNasin(40UΛL)1ΛL,MgCl22.4ΛL,DEPC水2.6ΛL,
RT2E1ΛL,总量为20ΛL的反转录反应体系,然后25℃5
。在我国,目前危害严重的主要是H5、H9亚型的
[326]
～1.5h后,70℃灭活5min。min,42℃1
1.5.2 多重PCR扩增 在总量为30ΛLPCR扩增体系中,分别加入10×PCR缓冲液(含1.5mmolLMg2+)2.8ΛL、2.5mmol混合引物3ΛLdNTP2ΛL、L(3对引物,每种引物终浓度为10pmmolL)、Taq聚合酶0.5ΛL、DMSO2.4ΛL、cDNA模板2ΛL,加灭菌超纯水至30ΛL,以30ΛL石蜡液体
准确而简便的定型方法。本试验根据AIV,急需快速、GenBank中AIV核蛋白(NP)基因和血凝素(HA)基因的保守序列设计3对引物,建立了快速检测AIVH5和H9亚型的多重RT2PCR扩增系统,并应用此体系检测了一批临床感染样品。
1 材料与方法
111 参考毒株与待检样品 AIV2H5、AIV2H9,为本实验室
灭菌覆盖。PCR扩增条件为:94℃预变性3min;94℃变性30
s,48℃退火40s,72℃延伸40s,共40个循环;72℃延伸10min后4℃保存。同时设立阴性对照。
116 PCR产物的序列测定 利用大连宝生物公司的DNA
分离保存;待检样品,为人工感染鸭泄殖腔和喉气管棉试子。
112 引物的设计 根据GenBank中已发表的AIVNP和
回收试剂盒,从琼脂糖凝胶中回收PCR产物克隆到pGEM2T载体中,转化DH5Α大肠杆菌,送上海联合基因公司完成
DNA序列测定。
117 多重RT-PCR特异性试验 用上述方法对AIV其他亚
型、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)的RNA,
2HA基因的高度保守序列,设计了3对特异性引物。NP2F:5′
,NP22GCACAGATATTGGGCTATAAGGAC23′R:5′;H5A2F:5′2TTGTCTCCGAAGAAATAAG23′ACACAT,H5A22GCTCAGGACATACT23′R:5′CTCTGATTC;H9A2F:5′2AGTGTTGATGT23′CTCCACACAGAG,H9A22GTTGTCACACTTGTTCACAATGG23′R:5′
进行多重RT2PCR。
118 多重RT-PCR灵敏度试验 用含108.5ELD50的尿囊液
。预期扩增的目的片段分别约为NP:330bp;GTTGT23′
H5A:550bp;H9A:480bp,由上海博亚公司合成。113 病毒扩增 将AI～72hV接种于10日龄SPF鸡胚,36 收稿日期:2004206229
基金项目:国家”十五“重点科技攻关计划项目(2004BA519A24);
江苏省“六大人才高峰”项目(G20022026);上海市科技兴农项目
(2002232422);扬州大学生物科学与技术学院基金项目
进行10倍的倍比稀释,分别取100ΛL抽提RNA,进行多重RT2PCR。
119 感染样品检测 用AIV人工感染鸭,3d后采集泄殖腔和喉气管棉拭子样品,用多重RT2PCR检测,同时做病毒分离和琼脂扩散试验对照。
2 结果
211 AIVRT-PCR扩增 利用设计的3对特异性引物,经系
作者简介:耿士忠(19722),男,讲师,硕士。 3通讯作者,E2mail:jiao@yzu.edu.cn
统优化后,成功地扩增出H5和H9亚型NP和HA基因特异性序列。PCR产物大小分别为,NP基因片段330bp,H5HA
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基因片段550bp,H9HA基因片段480bp(图1)。DNA序列测定结果与GenBank中报道的3种基因序列一致。
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了检测效率。本研究建立的多重RT2PCR在一个反应体系中同时扩增AIV的3个靶基因,其中NP基因用来鉴定AIV的型,H5、H9HA基因用来鉴定AIV的亚型,而且具有良好的特异性和敏感性。结果初步表明,多重RT2PCR方法的建立为临床及实验室提供了一种快速、特异、灵敏的检测AIV并鉴定其亚型的方法。
另外研究中发现,本研究建立的多重RT2PCR对引物的要求相当高。在同体系中同时加入多对引物,同时扩增多个基因,引物对之间的匹配与否对多重RT2PCR的扩增结果影响很大,尤其是体系的特异性。因此,在设计多重PCR引物时,要考虑多个因素,如引物的退火温度应大致相近;各个靶基因之间避免扩增交叉和大量的引物二聚体的形成;基因片段大小有一定梯度,以便于电泳分辨等。
图1 多重RT2PCR扩增电泳结果 11200bpMarker;2,3.H5
AIV;4.H5+H9AIV;5.H9AIV;6.H1AIV;7.H3AIV;8.H6AIV;9.H6AIV;10.IBV;11.NDV;12.阴
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性对照
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212 多重RT-PCR特异性试验 采用几种其他亚型AIV以及NDV、IBV进行对照试验,未见有阳性结果(图1)。213 多重RT-PCR灵敏度试验 将108.5ELD50的尿囊液进
中国预防兽医学报,1998,20(2):1052107.
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行10倍的倍比稀释,RT2PCR结果是,稀释106倍的尿囊液能够扩增出清晰的条带,其灵敏度至少达到102ELD50。214 临床试验 运用AIV人工感染鸭,采集泄殖腔和喉气管棉拭子样品,经RT2PCR检测和病毒分离鉴定、琼扩试验,3种方法结果一致,均在105份样品中检测到73份阳性样品,32份阴性样品,符合率为100%。3 讨论
本研究建立的多重RT2PCR方法是对单基因RT2PCR检测AI它是在同一RT2PCR反应体系中加V的发展和完善。
入多对特异性引物,实现1次扩增多个靶基因。单基因RT2PCR系统1次只能检测1种基因,对基因分型就显得操作繁琐,费时且成本高,而多重RT2PCR则有效地解决了上述问题,使得AI的基因分型变得简捷,而且减少了误诊率,提高
国预防兽医学报,2000,22:73276.
MultiplexRT-PCRforDetectionofDifferentSubtype(H5andH9)ofAvianIn-fluenzaVirus
11,2111,232
,LIGENGShi2zhong,ZENGXian2ying,PANZhi2ming,HUANGJin2lin,JIAOXin2anUXiu2fan
(1.CollegeofBioscience&Biotechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225009,China; 2.AnimalInfectiousDiseaseLaboratoryofMinistryofAgricultureofPRChina,YangzhouUniversity, Yangzhou,Jiangsu225009,China)
Abstract:AmethodofmultiplexRT2PCRfordetectingthedifferentsubtypes(H5andH9)ofavianinfluenzavirus(AIV),basedonreversetranscriptase(RT)andpolymerasechainreaction(PCR)technique,wasdevelopedtoamplifyatthesametimethetwospecificgenefragmentsofAIV:NPgenefragment(330bp)whichdeterminethetypeofAIVandHAgenefragment(H5:550bp;orH9:490bp)whichdeterminethesubtypeofAIV.Comparedwithagargelprecipitation(AGP)serological
method,105samplesweredeterminedforthedifferentsub2types(H5andH9)byRT2PCR.ThesensitivityofmultiplexRT2PCRisupto102ELD50.TheresultsrevealedthatmultiplexRT2PCRisaveryrapid,sensitiveandspecificmolecularassayfordetectionandsubtyping(H5andH9)oftheavianinfluenza.
Keywords:avianinfluenzavirus;NPgene;HAgene;multiplexRT2PCR 3Correspondingauthor,E2mail:jiao@yzu.edu.cn
