E花环形成试验

实验者： 学号： 同组者：

一．实验目的

1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。 2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。

二．实验原理

人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）的受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团（即E花环）。由于T细胞的异质性，其中在4℃放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et花环)，而T细胞与SRBC混合后不经4℃作用立即反应形成的花环数称为活性花环（Ea花环）。

三．实验用品

1.实验试剂：肝素抗凝静脉血、Hanks液（实验中以过期10培养基代替）、PBS缓冲

液、淋巴细胞分离液、绵羊红细胞悬液、0.8% 戊二醛、瑞氏染液。 2.实验器材：吸管、玻片、试管、离心机、显微镜。

四．实验过程

1.淋巴细胞悬液的制备

取肝素抗凝血2ml，加入2ml Hanks液稀释液后叠加于2ml分离液上，离心2000r/min，20min；用毛细吸管吸出位于血浆和分离液之间的乳白色单个核细胞层（如图1所示），加入

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5ml Hanks 液洗2次（1500r/min，10min），弃上清液，用Hanks 液配制成1-2×10/ml细胞。

图1 淋巴细胞分离示意图

2.绵羊红细胞悬液的配制

将保存于Alsever’s液中的绵羊红细胞，用5-10倍量生理盐水洗3次（1500r/min，

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离心10min）弃上清液，用生理盐水配制成0.5%的SRBC悬液（10个细胞/ml）。 3.Et花环试验

(1) 取2ml 0.5%SRBC悬液和1ml含淋巴细胞的PBS加入离心管中，混匀，置37℃水浴5min

(2) 取出离心500r/min 5min,置4℃1-2h或过夜。 (3) 沿管壁加入0.8%戊二醛2ml,置4℃ 20min。 (4) 弃适量上清，约留2ml,轻轻吹吸混匀沉淀细胞。

(5) 结果观察 ①湿片法观察：取1d细胞悬液滴加于载玻片上，加少许吉姆萨-瑞氏染液染

色，加盖玻片后高倍镜下观察；②干片法观察：取细胞悬液涂片，自然干燥，用吉姆萨-瑞氏染液染10min，水洗，干燥，高倍镜或油镜下观察。 4.Ea花环试验

与Et花环试验基本相同，不同之处是SRBC悬液的浓度为0.1%，SRBC与T细胞混合之比为10:1～20:1，混合后立即离心500r/min 5min，加入0.8%戊二醛固定。 判定结果：

淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，SRBC不着色，凡结合3个SRBC或以上者为E花环形成细胞（ERFC）。

要求： 计数200个淋巴细胞，求出E花环形成率（%）

形成花环细胞数E花环形成率（%）= 形成花环细胞数未形成花环细胞数 ×100%

五．实验结果

如图2所示为活性花环（Ea花环）

图2 40×镜下 活性花环（Ea花环）图

如图3所示为总花环(Et花环)

图3 40×镜下 总花环（Et花环）图

六．分析讨论

1. 经查相关资料，E花环试验常用作人外周T细胞的分离与鉴定，一般认为ERFC的正常值在60％以上，如少于50％则为低下，而活性E花环（Ea花环）可能代表T细胞的一个亚群，正常值仅为总E花环的1/3～1/2，约20％～40％。如欲分离T细胞，可用密度梯度离心，ERFC因比重增大而沉于管底，与其他细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。

2. 本次实验所得花环数较少，后未要求进行统计计数，但初步估计E花环形成率约20%～30%且Et花环与Ea花环相差不大，可能的原因有：①. 影响E花环实验最主要的因素淋巴细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新鲜，无菌，采血后要求在3h～4h内进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血，所以可能是血样活力不足，T淋巴细胞与绵羊红细胞比例稍低造成花环较少。②. 通常Hank’s液的pH以7.2～7.4为宜，实验中以过期10培养基代替，有可能影响结合的稳定性。③未控制好反应温度、时间等条件，一般37℃作用10min，低速离心5min，置4℃ 2h～4h，其结果稳定性较好，结合率较高。本次实验4℃保存1小时，可能反应不充分。④.可能是计数前吹吸混匀时力度过大，造成花环解离。

3. 本次实验戊二醛固定是通过绵羊红细胞与T细胞表面的氨基交联固定（关于试剂中的醛基是否参与形成醛亚胺键，目前还有争论。但是普遍认为，戊二醛的作用可能是戊二醛水溶液中存在的α－、β－不饱和齐聚物的乙烯键与自由的氨基结合），使花环结合部位稳定。氨基与戊二醛之间的交联是不可逆的，所以先固定后吹吸混匀再染色计数，可减少机械力分开结合花环。

4. 其他注意事项：①.SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高。②.计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。③.温度对实验结果影响较大，故实验条件温度应保持一致，从4℃取出后应立即计数。