化学发光磁微粒免疫分析法定量检测HBsAg
周齐洋;金晶;江波;先小龙;颜彬;吕华;苏恩本
【摘 要】目的 建立定量检测HBsAg的化学发光磁微粒免疫分析法.方法 2株抗HBs单克隆抗体分别标记吖啶衍生物和生物素化,生物素化的抗HBs通过链霉亲合素包被到磁珠上形成致敏磁珠.将待测标本加入吖啶标记的抗HBs(吖啶-抗HBs)与致敏磁珠的体系中,形成致敏磁珠-HBsAg-吖啶标记抗HBs夹心复合物,磁性分离清洗.重复加样1次,磁性捕获分离后激发吖啶衍生物发光,用化学发光分析仪检测光强度,计算标本中HBsAg的浓度.结果 该法线性方程为Y=0.919X +4.28,相关系数r2为0.99,线性范围为0.019 7～250.00 IU/mL.灵敏度可达0.020 7 IU/mL.0.1、3.2和40 IU/mL样本各重复测定10次的变异系数(CV)值分别为2.70％、4.40％和2.70％.与Abbott公司HBsAg定量检测试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)检测40份标本浓度的线性相关方程为Y=0.980 8X+0.209 9,r2=0.99,两法结果差异无统计学意义(江1.519,P＞0.05).以10、50、100和200 IU/mL作为检定点,各检定点相对偏差分别为0.18％、1.50％、1.71％和1.81％.结论 建立的方法有较高的灵敏度、合适的线性,同时具备良好的可重复性,与Abbott公司试剂盒检测结果高度相关.
【期刊名称】《临床检验杂志》 【年(卷),期】2013(031)011 【总页数】2页(P836-837)
【关键词】磁珠化学发光免疫分析法;灵敏度;HBsAg 【作 者】周齐洋;金晶;江波;先小龙;颜彬;吕华;苏恩本
【作者单位】东南大学生物科学与医学工程学院,南京210096;江苏省医疗器械检验所,南京210022;南京基蛋生物科技有限公司,南京211505;南京基蛋生物科技有限公司,南京211505;南京基蛋生物科技有限公司,南京211505;南京基蛋生物科技有限公司,南京211505;东南大学生物科学与医学工程学院,南京210096;南京基蛋生物科技有限公司,南京211505 【正文语种】中 文 【中图分类】R446.6
HBsAg阳性为HBV感染的标志。化学发光微粒子免疫分析(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)法因其检测速度快以及可以全自动化备受青睐，近年来逐渐取代ELISA法而成为大型医院检验科常备的检测HBsAg的手段。Abbott公司CMIA定量检测HBsAg试剂盒的参考值为<0.05 IU/mL，检测的灵敏度很高，但尚无国产同类试剂。为此，本研究建立了一种可大幅度提高HBsAg检测灵敏度的化学发光磁微粒分析方法。
1.1 标本来源 收集2013年1～6月南京市第二人民医院检测HBsAg的血清标本40份。以Abbott公司HBsAg定量检测试剂盒(CMIA法)检测HBsAg浓度，其中25份阴性(<0.05 IU/mL)，15份阳性(>0.05 IU/mL)。
1.2 仪器与试剂 MagiCL 6800全自动磁微粒化学发光免疫分析仪、小鼠抗HBs单克隆抗体GP3SAB、GP7SAB(南京基蛋公司)，酪蛋白(上海拜力公司)，氨基磁性微珠(天津倍思乐色谱技术开发中心)，吖啶衍生物(上海迈拓崴公司)，生物素琥珀酰亚胺酯、链霉亲合素(美国Thermo Fisher公司)，Tween-20、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠(南京化学试剂公司)，Proclin 300 防腐剂(美国Sigma-Aldrich公司)。 1.3 试剂制备
1.3.1 生物素化GP3SAB制备[1] 按照物质的量比1∶100的比例将生物素琥珀酰亚胺酯溶液(10 g/L)迅速加至GP3SAB单抗中，37 ℃温育2 h后取出，置于4 ℃用PBS(20 mmol/L，pH 7.5)透析，每4 h更换1次透析液，更换1～2次。透析结束后加入储存添加液和甘油后置-20 ℃保存。
1.3.2 吖啶衍生物标记GP7SAB 按物质的量比1∶70的比例将吖啶衍生物(4 g/L)迅速加入GP7SAB单抗中，37 ℃温育2 h后取出，用20 mmol/L PBS(pH 7.5)置于4 ℃透析，每次使用4 L透析液，每6 h更换1次透析液，使用MagiCL 6800全自动磁微粒化学发光免疫分析仪测定透析液的相对发光强度(RLU)，直至透析液测定RLU低于1 000，将吖啶衍生物标记GP7SAB加入甘油保存。
1.3.3 磁珠包被链霉亲合素[2] 取1 mL 5 mg/mL的氨基磁性微珠悬液于离心管中，磁性分离，去除上清；用6 mL磁性微珠包被液(20 mmol/L PBS，pH 7.5)将磁性微珠重悬浮；加入25%戊二醛2 mL于悬液中，活化3 h；用磁性微珠包被液洗涤活化磁性微珠3次，磁性分离弃上清；将清洗好的磁性微珠悬浮于磁性微珠包被液中，加入5 mg/mL的链霉亲合素0.5 mL后，反应6 h；磁性分离，去除上清，将已包被磁珠悬浮于包被液中，再加入2 g/L BSA，混匀，封闭30 min后，再加入2 g/L甘氨酸封闭30 min。
1.4 标准曲线制作 取经Abbott公司HBsAg定量检测试剂盒标定浓度为2 955 IU/mL的校准品，按20、60、300、1500、7 500、15 000、30 000、45 000、150 000倍的比例用稀释液(13.605 g/L磷酸二氢钠、9.67 g/L磷酸氢二钠、9 g/L氯化钠、10 g/L酪蛋白，0.1% Proclin 300和0.1% Tween-20)稀释成一系列浓度的校准品。对仪器检测的RLU取以10为底的对数作为Y，对校准品的浓度(IU/mL)取以10为底的对数作为X，对Y和X线性拟合作标准曲线。 1.5 测定方法 将链霉亲合素包被的磁性微珠和生物素化的GP3SAB按照质量比1∶0.025进行预反应，两者混合后置37 ℃摇床220 r/min振摇0.5 h使之成为
磁性微珠-链霉亲合素-生物素化GP3SAB的致敏磁性微珠，用50 mmol/L PBS溶液(pH 7.5)混悬置4 ℃保存。将10 μL致敏磁性微珠和10 μL吖啶衍生物标记的GP7SAB加入到100 μL待测样本中，37 ℃温育10 min后用洗液清洗磁性微珠3次。再次加入10 μL致敏磁珠、10 μL吖啶衍生物标记的GP7SAB和100 μL待测样本，37 ℃温育10 min后再次用洗液清洗磁珠3次。二次洗净的磁珠送入MagiCL 6800分析仪测量，结果代入标准曲线算出样本中HBsAg的浓度。 1.6 统计学分析 用SPSS Statistics 19软件进行。对测定结果作直线回归分析，计算相关系数，进行相关性分析；测定结果间的比较用配对t检验。以P<0.05为有统计学意义。
2.1 最佳反应条件优化 用单因素实验方法，对致敏磁珠、待测样本和吖啶衍生物标记的GP7SAB不同水平进行考察。结果显示，在10 μL致敏磁性微珠、10 μL吖啶衍生物标记的GP7SAB加入到100 μL待测样本中进行反应时，分析灵敏度最佳，为0.021 IU/mL。故选择此模式作为本法最佳的测定模式。
2.2 线性范围 本法的线性方程为Y=0.919X+4.28，r2=0.99。校准品每个浓度点的响应值均较高，有较好的斜率(0.919)和高的相关系数。线性范围为0.019 7～250.00 IU/mL。
2.3 分析灵敏度 用建立的CMIA法测定20份蒸馏水的RLU，计算平均值和标准差(s)，将值代入标准曲线算出测定浓度，即为分析灵敏度。结果本法的本底发光值为374.4，s为82.76，分析灵敏度为0.020 7 IU/mL。
2.4 重复性测试 用本法分别重复10次测定用Abbott公司HBsAg定量试剂盒标定浓度分别为0.1、3.2和40.0 IU/mL的样本。低值样本重复测定的结果为(0.110±0.006) IU/mL，变异系数(CV)值为5.4%。中值样本重复测定的结果为(3.17±0.14) IU/mL，CV为4.4%。高值样本重复测定的结果为(39.42±1.07) IU/mL，CV为2.7%。
2.5 与Abbott公司试剂比较 40份体检标本分别用Abbott公司试剂盒和本文建立的CMIA法测定HBsAg浓度，以Abbott公司试剂盒测定浓度值为X，本法测定浓度值为Y，线性拟合方程为Y=0.990 8X+0.209 9，r2高达0.99；Abbott法和本法检测结果分别为(34.98±53.22)IU/mL和(34.52±52.21)IU/mL，差异无统计学意义(t=1.519，P>0.05)。选取10、50、100和200 IU/mL作为检定点，代入线性拟合方程计算各点的预期偏差分别为0.017 9、0.750 1、1.710 1和3.630 1，相对偏差分别为0.18%、1.50%、1.71%和1.81%。
本研究改进了加样模式，在全自动磁微粒化学发光免疫分析仪上通过软件设置实现。结果发现，本文建立的化学发光磁微粒免疫分析法的r2为0.99，双对数线性拟合标准曲线斜率为0.919；分析灵敏度为0.020 7 IU/mL，可达到Abbott公司CMIA试剂水平。同时该法也有较高的重复性，与Abbott公司HBsAg定量试剂盒结果的r2高达0.99，两者测定结果差异无统计学意义。将10、50、100和200 IU/mL作为检定点进行准确度分析，结果各点相对偏差分别为2.04%、4.69%、5.02%和5.18%，能满足临床检测需要。鉴于血清HBsAg定量近年来受到肝病临床专家的广泛重视[3]，拟在本文工作的基础上进一步完善试剂的制备，规范操作技术，进行大样本的临床验证，以便早日投入临床常规应用。
【相关文献】
[1]庞秋霞,屈艺,魏大鹏，等.生物素化抗AIB1单克隆抗体的制备及应用研究[J].四川大学学报(医学版), 2009, 40(4): 727-729.
[2]梁媛媛,温汉华,郭卫强，等.用于亲和分离的链霉亲和素磁性高分子微球的制备[J].杭州师范大学学报(自然科学版), 2013, 12(2): 145-149.
[3]武建国.HBsAg与HBV DNA定量测定的临床信息互补[J].临床检验杂志,2013,31(11):801-804.
