DNA电泳常见问题分析

凝胶电泳操作注意事项

一、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，阻碍DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地利用。

2、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。

3、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常常更新电泳缓冲液。

4、 样品加入量：一般情况下，宽的梳子可加μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，可是上样量过量会造成加样孔超载，从而致使拖尾或弥散，关于较大的DNA此现象更明显。 五、 DNA样品中盐浓度会阻碍DNA的迁移率，平行对照样品应利用一样的缓冲条件以排除这种阻碍。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。

7.选择的实验材料要新鲜，处置时刻不易太长。

8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必需均匀分散，以减少DNA团块形成。

9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

11.分光光度分析DNA的A280/A260小于；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情形下，应加入SDS至终浓度为%，并重复步骤2～8。

12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量

DNA电泳常见问题分析之一

1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED仍是过硫酸铵？胶聚时刻很长如何解决？ 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时刻长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时刻太久也会失效的。 一个让PAGE胶很快聚合的方法：

不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。

2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？

一、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。

2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。 3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。 3 跑出的DNA带模糊？ 一、 DNA降解：幸免核酸酶污染。

2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。

5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

4 有不规那么DNA带迁移?

一、 关于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。 2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；常常改换电泳缓冲液。 3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。

5 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？

一、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。

2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。

6 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?

一、 假设是是小DNA带走出凝胶，能够缩短电泳时刻或降低电压或增强凝胶浓度。 2、 分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。 3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。

DNA链庞大，常规凝胶电泳不适合??在脉冲凝胶电泳上分析。

7 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是4BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为何？

有时只靠电泳结果判定是不准确的，一样的片段每次跑的远近会有不同。有体会显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证明片段没有问题。也有做的一个片段也是如此，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示确实是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全数都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才明白全然没有问题。

8：为何marker条带超级模糊，无法分辨具体条带？ A：显现上述情形，可能有以下几个缘故：

1. marker条带显现了降解。请确保在利用进程中幸免核酸酶污染；2.

电泳缓冲液陈腐。电泳缓冲液多次利用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而阻碍电泳成效，建议常常改换电泳缓冲液；3. 电泳条件不适合。电泳时电压应不超过20V/cm，温度应低于30℃；4. marker上样量过量。请根听说明书选用适合上样量；5. 凝胶质量不行。建议利用质量较好的琼脂糖；另外，凝胶凝固不均匀也会致使条带模糊。

9：为何marker条带显现不规那么的条带（如哑铃状等）？

A：显现上述情形，多与以下几个缘故有关：1. 电泳缓冲液陈腐。老化的电泳缓冲液离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而阻碍电泳成效，建议常常改换电泳缓冲液；2. 电泳条件不适合。电泳时电压应不超过20V/cm，电压太高可能也会致使marker条带显现不规那么现象。另外，凝胶质量差和凝胶冷却时凝固不均匀也会致使该现象显现。

10为何marker条带超级弱或全然没有条带？

A：显现上述情形可能是：1. marker上样量较低，可适当增加上样量；2. 凝胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会致使电泳条带弱或全然没有条带；3. 电泳时刻太长致使marker条带跑出凝胶，可缩短电泳时刻，降低电压，增加凝胶浓度。

11：为何marker缺带？

A：关于含有较小片段的marker，假设是显现缺带现象，可能是因为：

1. 小条带跑出凝胶或分子量大小超级相近的条带不易识别所致，可适当缩短电泳时刻，降低电压，同时增加凝胶浓度；2. 凝胶中EB含量太低，致使大片段结合EB量太少或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加EB用量。

问题 原因 DNA降解 电泳缓冲DNA液陈旧 带模糊 所用电泳电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳， 响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影解决办法 避免核酸酶污染 条件不合适 温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 DNA上样量过多 DNA样含盐过高 有蛋白污染 DNA变性 对于λ/Hind III片段不规则cos位点复性 DNA带迁电泳条件不合适 移 DNA变性 减少凝胶中DNA上样量 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 电泳前酚抽提去除蛋白 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA 电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟 电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳 DNA的上样量不够 灵敏度稍高，上样量可适当降低 带弱或无DNA带 DNA降解 DNA走出凝胶 对于EB染色的DNA，应用短波长（254nm）的紫外光源 所用光源不合适 小DNA带走出凝胶 分子大小相近的DNA增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 DNA带缺失 DNA 变性 DNA DNA链巨大 问题 可能原因 常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析 解决方法 带不易分辨 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 避免DNA的核酸酶污染 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 DNA Marker降解 核酸酶污染 每次吸取时更换灭菌头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存 保存不当 4°C 或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热 DNA Marker无法正确分离 条带黯淡 琼脂糖质量差 电泳缓冲液多次使用后失效 使用质量可靠的琼脂糖制胶 更换缓冲液 核酸浓度过低 核酸降解 品 DNA条带被示踪染料掩盖 增加上样量 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料 条带模糊或弥散 电泳缓冲液多次使用后失效 核酸部分降解 品 核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 电压过低，电泳时间过长 更换缓冲液 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散 条带缺失 DNA条带分子量过大 分子量接近的DNA条带没有分开 电泳结束后及时观察、拍照 使用脉冲凝胶电泳 选择适当的凝胶浓度进行电泳 电泳缓冲液使用不当 SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶 电极插反，DNA走出凝胶 缩短电泳时间，调整电压 正确连接电极方向 加热处理或重新制备样品 电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样 判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 条带大小不正确 核酸降解或形成聚合物 λ DNA酶切Marker的cos位点复性 相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率 梳子变形，点样孔不在同一水平线上 带型异常 不同样本的上样条件不同 使用完好的梳子制胶 选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近 上样量过大或过小 选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部 核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 电泳缓冲液未完全浸没凝胶 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶 电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 凝胶中加入EB造成染色不均 色 凝胶中有气泡或污染物 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 加入EB时充分混匀或电泳结束后再染 使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡 点样孔质量差 待凝胶完全凝聚后再取出梳子；