苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

广东医学　2009年4月第30卷第4期　GuangdongMedicalJournal　Apr.2009,Vol.30,No.4

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(收稿日期:2008-10-27　编辑:庄晓文)

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pyonboneturnoverinsubchondralboneandepiphysealmetaphy2sealcancellousboneofovariectomizedcynomolgusmonkeys[J].JBoneMinerRes,2004,19(5):823-829.

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的3

实验研究

龚独辉,潘明新,姚坤厚,夏武政,康玉占,汪艳,高毅南方医科大学珠江医院肝胆外科(广州510282)

　　【摘要】　目的　观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法　改良肝细胞获取方法分离人

77777-1

胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度(1×10,215×10,5×10,715×10,10×10・mL)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO为冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进

7-1行活率、形态学及功能检测。结果　5种不同浓度的细胞冻存1个月后,细胞浓度为215×10・mL组复苏后存活率与其余四组相比差异有显著性(P<0105),且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为

△△73%,69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论　(1)苦参碱对低温冻存的人胎肝细胞有保护作用,与二

7

甲基亚砜联用可降低DMSO的浓度;(2)以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在215×10・

mL冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。

-1

【关键词】　生物人工肝;人胎肝细胞;冷冻保存;苦参碱

　　肝细胞是生物型人工肝(bioartificialartificialliver,BAL)的主要生物成分,在BAL中起核心作用,其支持作用主要来源于肝细胞的生物代谢功能。人肝细胞作为BAL的种子细胞,具有安全性好,细胞生物学功能相同,能提供同源生物活性物质。人胎肝细胞还具有在体外继续分化增殖和免疫原性弱的优点。上述优点是其他细胞材料不具备的,故人胎肝细胞理论上为BAL的理想细胞材料。临床使用的生物反应器内细胞

9

数量至少应该达到人肝细胞总量的15%,即约10个

[1]

数量级方具有临床意义。将肝细胞大量冻存建立肝细胞库,是解决大量肝细胞来源的重要方法。对冻存而言,冻存保护剂对复苏后的存活率起着很重要的作用;我们前期研究将苦参碱用于低数量级的人胎肝细

[2-4]

胞和人肝细胞的冻存上取得了良好的效果,本实验尝试在前期实验的基础上以苦参碱作为冻存保护剂应用于胎肝细胞的高数量级的冻存,观察其效果。

1　材料与方法

1.1　材料　实验于2007年8月至2008年5月在珠江

医院中心实验室完成。主要仪器和试剂:电子分析天平,台式高速离心机,超净工作台,OLYMPUS相差显微镜,微量加样器,全自动生化仪(Roche型),程序降温

　3国家高技术研究发展(863)计划项目(编号:2006AA02A141);广州市科技计划项目(编号:2006Z3-E0131)

　△通信作者:高毅,主任医师,教授,博士研究生导师;潘明新,主任医师,硕士研究生导师

仪(PlanerKryo560-16),苦参碱(西安,富捷),胎牛

血清(杭州四季青),二甲亚砜(DMSO)(Sigma),胶原蛋白酶Ⅳ(Sigma),015%台盼蓝溶液(Sigma),RPMI-1640(HyClone),250mL骨髓干细胞冻存袋(Baxter)。胎肝来源:米非司酮加米索前列醇引产胎儿(孕妇乙肝六项指标均阴性,肝功能正常,无已知传染病,非宫内死胎,12～16周,约70g);来源于本院妇产科,并与家属签署知情同意书。112　方法

11211　胎肝细胞的获取　取3～4月胎龄的引产死胎,用碘酒、酒精消毒腹部皮肤,打开腹腔无菌摘取肝

2+2+

脏,先以37℃无Ca/Mg的Hanks液沿肝组织血管进行第一步灌流,待流出液体转清后,改用37℃含2+

Ca的0105%胶原酶液进行第二步灌流,速度为5mL/min,待肝包膜下组织呈龟背状裂隙,胶原酶液充满包膜下后停止,用镊子钝性撕碎,去除其他结缔组织,置胶原酶液37℃水浴震荡消化20min,200目细胞筛过滤,50×g离心3min,弃上清加RPMI-1640培养液,再次离心,反复洗涤3次获取肝细胞。分离的细胞经015%台盼蓝染色、计数、计算细胞活率,备用。11212　不同细胞浓度的冻存和复苏　将分离的肝细

8-12

胞以2×10・mL的浓度接种到75cm培养瓶中置于CO2孵箱预培养1h,然后以6mg/L苦参碱液+5%DMSO、20%胎牛血清作为冻存液,将胎肝细胞分别调

7-17-17

整浓度为1×10・mL,215×10・mL,5×10・

-17-17-1mL,715×10・mL和10×10・mL。将上述浓

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度的胎肝细胞各50mL,分别装入250mLBaxter骨髓干细胞冻存袋中。将冻存袋置于程序降温仪(Kryo560-16,Planer)中进行程序降温。程序降温仪采用的降温方式为10min降至0℃并维持在此温度8min,4min降至-8℃,1min降至-28℃,2min降至-33℃,2min将温度升为-28℃,16min将降至-60℃,4min降至-100℃,将冻存的细胞从程序降温仪中取出,放入液氮中继续冻存。1个月后将其从液氮中取出的。快速置于40～42℃水浴中震荡1～2min直至细胞悬液完全融化,取出冻存肝细胞悬液10mL置于15mL离心管中,2000r/min,离心5min弃上清液,细胞重新混悬于含10%FBS的新鲜培养液中然后用台盼蓝拒染法计算细胞存活率。11213　细胞存活率检测　取100μL细胞悬液,加100μL015%台盼蓝溶液混匀,取1滴至血细胞计数板,倒置显微镜下3min内计数100个细胞,染为蓝色者为死亡细胞,计算细胞活率。

6

11214　24h贴壁率检测　取110×10个未冻存和冻存不同时间的人胎肝细胞接种于25mL培养瓶中,置37℃5%CO2孵箱中培养,24h后更换为新鲜培养液,上清液离心后计算24h贴壁率,以后每天更换1次培养液。并收集第1,2,3,4,5天上清液(-20℃保存)备检。24h贴壁率=(接种肝细胞的总数量-24h后上清液中肝细胞数量)/接种肝细胞的总数量×100%。11215　形态学观察　每天换液前后在倒置相差显微镜下观察培养肝细胞的生长情况及形态变化。

7-1

11216　肝细胞功能的测定　(1)2.5×10・mL组胎肝细胞冻存1个月后复苏再培养,每24h换液1次,用全自动生化分析仪检测上清液中白蛋白、AST、LDH含

6

量;(2)氯化铵转化试验,取1×10个未冻存的和不同冻存浓度组的人胎肝细胞,培养3d后去上清液,用PBS缓冲液冲洗2次,然后加入含4mmol/L氯化铵的无血清DMEM培养液,于2,6,12,24h后分别留取标本,在生化分析仪上检测上清液中尿素含量。113　主要观察指标　(1)肝细胞的形态;(2)不同细胞浓度冻存复苏后细胞的存活率;(3)培养液上清中LDH、AST含量,肝细胞白蛋白及尿素合成能力。114　统计学方法　应用SPSS1115统计软件,整体比较采用重复测量方差分析,相同时间点之间比较采用one-wayanova分析,两两比较用LSD法。

2　结果

211　不同细胞浓度冻存后肝细胞存活率　细胞浓度1×10,215×10,5×10,715×10和10×10・mL的存活率分别为(69±2)%,(73±2)%,(59±3)%,

7

7

7

7

7

7

-1

212　胎肝细胞冻存不同时间存活率和24h贴壁率　

刚分离的胎肝细胞的存活率为(93±1)%,明显高于冻

存不同时间的各组胎肝细胞,差异有显著性(P<0105),但冻存不同时间的各组之间差异无显著性(P>0105)。刚分离的胎肝细胞24h贴壁率为(88±2)%,与冻存不同时间的各组胎肝细胞相比差异有显著性(P<0105),但冻存不同时间的各组之间24h贴壁率差异无显著性(P>0105)。见表1。

表1　胎肝细胞冻存不同时间复苏后的　存活率和24h贴壁率

项目存活率贴壁率无冻存组93±1388±23

(珋x±s)%

冻存1周组71±268±2

冻存2周组71±266±1

冻存1月组

71±368±2

冻存3月组

72±268±2

　3与冻存复苏后各组比较P<0105

2.3　细胞型态学观察　2.5×10・mL组胎肝细胞

7-1

冻存1月后复苏再培养,倒置显微镜下观察细胞形态,

见图1。

1:冻存1个月后;2:复苏培养第1天;3:复苏培养第5天

图1　215×107・mL-1组胎肝细胞冻存1个月后及复苏再培养细胞

形态(台盼蓝染色,×100)

2.4　培养液上清中的LDH、AST、白蛋白的含量　见

图2。

2.5　氯化铵转化试验　检测得出上清液中尿素含量见图3。

3　讨论

(58±3)%和(57±3)%。细胞浓度为215×10・

-1

mL组复苏后存活率明显高于其余4组(P<0105),

其中5×10・mL,715×10・mL,10×10・mL3组之间差异无显著性(P>0105)。

7-17-17-1

终末期肝病常需要生物人工肝(BAL)来维持患者的生命,为患者等待肝移植提供条件和时间。临时应用BAL可以解决急性肝功能的失代偿,促进肝细胞再

[5-6]

生,肝功能完全自然恢复,病情康复。BAL虽然经过了多年广泛深入的实验研究,但其细胞材料来源问题至今尚未解决。目前认为人肝细胞是生物人工肝理想的细胞材料,它安全性好、细胞生物学功能相同,特

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别是能够提供同源的生物活性物质,如白蛋白、肝细胞

再生因子、凝血因子等。胎肝细胞还具有在体外继续分化增殖和免疫原性弱的优点,这些是其他细胞材料不具备的,故人胎肝细胞理论上可作为BAL理想的细胞材料。BAL要代替肝脏,除了细胞材料必须具有肝脏特异性代谢功能外,还需要大量肝细胞,至少达到

9

15%的人肝细胞数量,即约10个数量级才有临床意[1]

义。为了满足临床上对肝细胞数量的需求,传统上采取传代培养及用特殊材料为载体进行高密度培养方法,但其工作量大、易污染、费用高、对环境要求高,而且肝细胞经多次传代后,其活性、功能将降低。而大规模肝细胞冻存可以克服肝细胞多次传代培养的缺点,是短期内获得大量肝细胞的较好方法。

目前常用的肝细胞冻存方法有两种:将肝细胞保存于-70～-80℃或者-196℃,大量实验证实,把肝细胞冻存在液氮效果较好。影响肝细胞冻存的因素较多,冻存保护剂就是其中关键因素之一。DMSO是渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性,是肝细胞冻存最常用的保护[7]

剂。DMSO冻存肝细胞优于其他冻存保护剂,其浓度在5%～20%之间,但存在种属差别,如冻存鼠肝细

[8]

胞时最适浓度是16%,猪肝细胞最适浓度范围10%

[9][10]

～16%,人肝细胞则为10%～12%。但DMSO存在严重的毒性作用,与蛋白质疏水基团发生作用,导致蛋白质变性,因此,在肝细胞冻存过程中尽可能地减少DMSO的用量以降低其对肝细胞的毒性。随着DMSO用量减少了,其保护效果将降低。有人用5%DMSO与其他性质的保护剂(羟乙基淀粉)联合使用液氮下冻存猪肝细胞,结果比单用10%DMSO效果好,且把DM2

[11]

SO的浓度由10%降低到5%。鉴于DMSO的缺点,我们在前期试验中寻找到一种与其有相似作用,且能产生协同保护作用来克服DMSO的不足的冻存保护剂———苦参碱。我们在前期的实验中将苦参碱用作冻存保护剂,能够减少DMSO的用量,在胎肝细胞和肝细

[2-3,12]

胞系的低数量级冻存方面取得了良好的效果。因生物人工肝的细胞材料数量级要求较高,故我们设计将苦参碱用于胎肝细胞的高数量级冻存,观察其冻存效果;进一步探讨肝细胞规模化冻存方法,为生物人工肝用肝细胞库的建立提供实验支持。

[4]

李永翔等做过人胎肝细胞的小数量级的冻存研

[13]

究,暂无胎肝细胞规模化冻存的研究,周霖等曾将猪肝细胞进行规模化冻存,取得了良好的效果。我们将分离的肝细胞进行1h预培养后,以6mg/L苦参碱联合5%DMSO作为冻存保护剂,以电脑程控降温的方式进行降温,然后在液氮中进行冻存。结果表明:细胞

7-1

浓度为215×10・mL组复苏后存活率最高;LDH和AST是反映细胞膜功能很好的指标,冻存胎肝细胞的

LDH和AST水平随培养时间的延长逐渐恢复到未冻

存组胎肝细胞水平,冻存对胎肝细胞的影响在培养第5天逐渐恢复。白蛋白和尿素分泌是反映肝细胞功能

7-1

的重要指标,我们主要检测了215×10・mL组培养液上清中白蛋白和尿素的含量,随培养时间的延长逐渐升高,第4天形成一个高峰,接近同一浓度未冻存胎肝细胞水平;同时,复苏后培养3d的胎肝细胞氨代谢功能亦逐渐恢复。

尽管我们实验结果说明以5%DMSO+6mg/L苦

7-1

参碱作为冻存保护剂,细胞浓度为215×10・mL组复苏后存活率最高,以及使用该浓度的冻存不同时间的胎肝细胞在培养4～5d即可达到生物人工肝应用的需求。但是改进降温方式是否可以达到更加好的冻存效果,以及该规模化存储方式是否适用于成熟肝细胞或基因工程细胞有待进一步的研究。

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(收稿日期:2008-10-19　编辑:张素文)

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