中国当代医药２０１４年ｌ１月第２１卷第３２期 ・论 著・ ＵＳＰ２２ ＳｈＲＮＡ慢病毒载体的构建及鉴定 余宏伟 廖志伟 庄雅靖 喻 芳 周同冲 广州医科大学附属肿瘤医院放疗二科．广州 ５１００９５ 【摘要】目的构建并鉴定ＵＳＰ２２基因ＳｈＲＮＡ慢病毒载体，为进一步研究ＵＳＰ２２基因在鼻咽癌中的作用机制奠定 基础。方法针对ＵＳＰ２２基因的编码序列设计并合成２条特异性干扰序列，序列两端含有性内切酶位点Ｈｐａ Ｉ 和Ｘｈｏ Ｉ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，５ 端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到ｐＬＬ３．７慢 病毒表达载体。连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经ｔｔｐａ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ酶切电泳鉴定，鉴定正确 的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体ｐＬＬ—ＵＳＰ２２一ｓｈＲＮＡ与包装载体质粒混匀共转染于２９３Ｔ细胞。通 过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体 ｐＬＬ－ＵＳＰ２２－ｓｈＲＮＡ。与包装载体质粒共转染２９３Ｔ细胞后测定慢病毒滴度为４ｘ１０’ＴＵ／ｍｌ。结论本实验应用相 关技术成功构建ＵＳＰ２２ ＳｈＲＮＡ慢病毒载体，为进一步研究ＵＳＰ２２基因的生物学功能奠定了基础。 【关键词】ＵＳＰ２２；慢病毒栽体；构建；鉴定 【中图分类号】Ｒ３４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７４—４７２１（２０１４）１１（ｂ）一０００９—０５ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳｈＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｇｅｎｅ【，ＩＳ ２２ ＹＵ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ ＬＩＡ０ Ｚｈｉ—ｗｅｉ ＺＨＵＡＮＧ Ｙａ－ｊｉｎｇ ＹＵ Ｆａｎｇ ＺＨＯＵ Ｔｏｎｇ－ｃｈｏｎｇ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｔｏ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００９５．Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＳｈＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｇｅｎｅ ＵＳＰ２２，ａｎｄ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒ— ｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ＵＳＰ２２ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｗｏ ｓｐｅｃｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｎ ｃｏｄｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ＵＳＰ２２ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．却８ Ｉ ａｎｄ Ｘｈｏ Ｉ ａｓ ｔｗｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ａｔ ｂｏｔｈ ｅｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．０ｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗａｓ ａｎｎｅａｌｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｓ ｏｆ ｏ１ｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｆｔｅｒ ５ ｅｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ ｐＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７（ＰＬＬ３．７）ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｎ ｏｎｌｙ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔ ｐｌａｓｍｉｄ ａｆｔｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ－ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＬＬ—ＵＳＰ２２一ｓｈＲＮＡ ａｎｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｗｅｒｅ ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｅｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌ１． Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｖｉｕｒｓ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＬＬ－ＵＳＰ２２——ｓｈＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ ４ｘ１０ ＴＵ／ｍｌ ａｆｔｅｒ ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌｌ ｗｉｔｈ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＵＳＰ２２——ＳｈＲＮＡ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉ・－ ｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ＵＳＰ２２． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＵＳＰ２２；Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ；Ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ 肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，ＵＳＰ２２泛 癌 、食管癌［５］、乳腺癌同等恶性肿瘤的浸润、转移和预 素水解酶属去泛素化酶ＤＵＢ基因家族成员，其普遍表 后差高度相关。沉默ＵＳＰ２２基因表达，能显著抑制膀 达表明其功能的保守性，因此，ＵＳＰ２２被归类为肿瘤 胱癌ＩＯ＇、结直肠癌阎细胞增殖。由此推测ＵＳＰ２２基因可 干细胞的标记基因而引起高度关注『ｌ１。国内外学者研 能成为肿瘤治疗的一个新靶点。本研究通过基因工程 究发现，ＵＳＰ２２基因过表达与结直肠癌［２］、肺癌［３］、胃 技术构建ＵＳＰ２２ ＳｈＲＮＡ慢病毒载体，为进一步研究 【基金项目】广州医科大学附属肿瘤医院重大专项（２０１１－ｙｚ一 ＵＳＰ２２基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验 ０６）；广州医科大学青年项目（２０１２Ａ１５） 基础。 【作者简介】余宏伟（１９８５一），硕士 １材料与方法 通讯作者：周同冲（１９６５一），主任医师，硕士生导师，主要从 １．１实验材料、试剂及仪器． 事鼻咽癌的研究 ｐＬＬ３．７慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广 ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｖｏ１．２１ Ｎｏ．３２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１ ４ ・论 著・ 中国当代医药２０１４年１１月第２１卷第３２期 州永诺生物科技有限公司。Ｔ４磷酸化酶、Ｔ４连接酶、 产物分别加入至５０ Ｉｘｌ Ｔｒａｎ５ｃ￣感受态细胞中．然后轻 ０ Ｉ酶及 ０ Ｉ酶均购自ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ） 公司。琼脂糖购自Ｂｉｏｗｅｓｔ公司。高纯质粒小量提取试 剂盒和Ｔｒａｎ５ｏｔ感受态细胞购自北京全式金生物公 轻地旋转使其混合均匀，冰浴时间３０ ｍｉｎ；②放置 ４２ 的水浴箱中热休克９０ Ｓ；③快速地将管转移至冰 浴中，冰浴时间２ ｍｉｎ；④分别加入５００ ｔｘｌ ＬＢ培养 菌液涂布于含氨苄青霉素（Ａｍｐ）（１００ ｔｘｇ／ｍ１）的ＬＢ 人３７℃生化培养箱过夜培养。 １．２．２．５质粒提取及鉴定从平板上面各接挑取６个 司。质粒大提试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ试剂盒）购自ＱＩＡＧＥＮ 基，混匀，３７ｏＣ、１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养４０ ｍｉｎ；⑤将１５０ ｌ 公司。溴化乙锭（ＥＢ）及ＬＢ培养基购自上海生工生物 库。Ｌｉｐ０ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（脂质体）２０００购自Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 公司。主要仪器包括水浴箱、恒温振荡器、台式离心 机、Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ加样和台式冷冻离心机、恒温摇床、 工程有限公司。２９３Ｔ细胞购自中国科学院上海细胞 平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移 菌落进行扩增培养，加入含有相应抗生素的３ ｍｌ ＬＢ培 电热恒温ＣＯ：培养箱、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超纯水系统、Ｂｉｏ—Ｒａｄ 养液中３７℃过夜培养，提取其质粒（高纯质粒小量提 琼脂糖凝胶电泳仪、ＳｙｎＧｅｎｅ凝胶成像系统、Ｏｌｙｍｐｕｓ 取试剂盒）。提取出来的质粒经ｔｔｐａＩ和Ｘｈｏ Ｉ酶切鉴 倒置荧光显微镜、一４℃冰箱、一２Ｏ℃冰箱等。 １．２方法 定，鉴定正确的质粒送中美泰和公司测序。测序正确的 质粒经大提（ＱＩＡＧＥＮ试剂盒）后保存于一２０￣Ｃ冰箱。 １．２．３慢病毒载体的包装、浓缩及滴度测定 １．２．１ Ｓ ＲＮＡ的设计与合成 运用Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ和Ｄｈａｒｍａｃｏ公司提供 １．２．３．１慢病毒的包装①转染前２４ ｈ，用胰酶消化对 的ＲＮＡ干扰设计工具，并结合ＲＮＡ干扰设计的原则， 寻找１９个碱基的靶序列。将编码ＳｉＲＮＡ的ＤＮＡ片 段设计成发夹结构．发夹结构的两端含性内切酶 数生长期的２９３Ｔ细胞。传代到１０ ｃｍ细胞培养皿中， 在３７ｏＣ、５％ＣＯ 的培养箱内进行培养。培养２４ ｈ后待 细胞密度达７０％～８０％时即可用于转染。细胞状态对 位点 口Ｉ及Ｘｈｏ Ｉ。ＳｉＵＳＰ２２—１：ＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＣＴ— ＣＡＡＣＡＡＴ，５ 一ＡＡＣＴ１ ！ ！ 一于病毒包装很重要，需保证良好的细胞状态及较少的 ＴＴ— ３ ， 传代次数。②转染前将细胞培养基更换成无血清培养 基，再将稀释后的ＤＮＡ（ｐＬＶ—ｇｅｎｅ载体１０ ｔｘｇ，ｐＧａｇ／Ｐｏｌ ＣＡＡＧＡＧ ＴＩ１ＧＴｒＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＧ ３ 一１ＴＩ’Ｇ ＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴ ＡＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡ ＧＴＦＣＴＣ 载体５ Ｉｘｇ、ｐＲｅｖ载体５ Ｉｘｇ、ｐＶＳＶ—Ｇ载体５ ｇ）与稀 释后的Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ ２０００混合。慢慢地颠倒以使相 ： ＧＡＧＣＴ一５ ；ＳｉＵＳ－ Ｐ２２—２：ＧＡＡＧＣＡＴＡＴｒＣＡＣＧＡＧＣＡＴ，５＇－ＡＡＣ 互混匀，但不要震荡，然后在室温下培育２０ ｍｉｎ，以形 成ＤＮＡ和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００稀释液的转染复合物。 亟 匾 亟 卿ＣＡＡＧＡＧ 亟亟 亘 唧Ｃ一３ ，３＇－ＴｒＧ 叵 ③将ＤＮＡ与Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００混合液转移至培养 的细胞培养箱中培养。培养６ ｈ后吸去含有转染混合 物的培养基，在每瓶细胞培养液中加入含１０％血清的 ！ ！ ＡＡＧＴｒＣＴＣ１ ＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴ一５ 。 充分混匀，放置于３７℃，５％ＣＯ △ △ ！ 坠 △△ △ｉ— ２９３Ｔ细胞的培养液中，１．２．２慢病毒载体的构建 １．２．２．１寡核苷酸链的退火反应体系：ｌ 寡核苷酸链，１ ｌ正义 培养基ｌ０ ｍｌ，再放置于３７℃、５％Ｃ０２的细胞培养箱 内继续培养４８ ｈ。 ｌ反义寡核苷酸，ｌ ｌ ２０ｘＳＳＣ Ｂｕｆｆｅｒ，加ｄｄＨ２０至２０ ｌ。反应条件：９５￣Ｃ，１０ ｍｉｎ后 １．２－３．２病毒的收获和浓缩①收集转染后４８ ｈ以及 ７２ ｈ的２９３Ｔ细胞上清液。在 ，４０００ｘｇ下离心１０ ｍｉｎ， 以除去细胞碎片。在０．４５ ｖｍ过滤器上过滤上清液于 自然冷却至室温。 １．２．２．２寡核苷酸双链５ 端的磷酸化因合成的寡核 苷酸链的５ 端没有被磷酸化。不利于载体的连接，故 需要磷酸化。反应体系：７ ｌ寡核苷酸双链，２．５ ｌ ｌＯｘＴ４ ＰＮＫ Ｂｕｆｆｅｒ，２．５ Ｉｘｌ ＡＴＰ．０．５ ｉｘｌ Ｔ４磷酸化酶， 加ｄｄＨ２Ｏ至２５ ｌ。反应条件：３７℃，３０ ｍｉｎ。 ５０ ｍｌ的离心管中。②将病毒粗提液样品加入过滤杯 中（最多１９ ｍ１），盖上盖子，在５０００ｘｇ离心，达到需要 的病毒浓缩体积（通常需要１０～１５ ｒａｉｎ）。离心结束后 过滤杯中即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液移出，分装 １．２．２－３将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到ｐＬＬ３．７ 后保存在病毒管中，可在４℃下保存１周，或在一８Ｏ℃冰 载体连接体系：１ ｌ ｐＬＬ３．７载体，１ ｌ寡核苷酸双 箱中长期保存。 链，１ ｌ １０ｘ连接Ｂｕｆｆｅｒ，１ ｌ Ｔ４连接酶，加ｄｄＨ２Ｏ至 １．２．３．３慢病毒滴度测定①在测定滴度的前一天，将 ２９３Ｔ细胞铺于９６孔板中．每个孔加入约４ｘｌ０４个细 １Ｏ １。反应条件：室温，３０ ｍｉｎ。 １．２．２．４连接产物的转化①冰浴中将５０—１００ ｎｇ连接 胞，体积为１００ ｌ。然后根据病毒的预期滴度，准备６一 ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｖｏ１．２１ Ｎｏ．３２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１４ 中国当代医药２０１４年１１月第２１卷第３２期 ・论 著・ １０个无菌的Ｅｐ管，在每个Ｅｐ管中加入９０ ｌ的无血 ＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴｒＡＴＧＧＧＡＣＴＩＴＣＣＴＡＣｒｒｒＧＧ— ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧ— 清培养基。②吸取待测定的病毒原液ｌ０ ｌ加入第一 个管中，记为１Ｅ＋Ｉ ｌ；充分混匀后，取１Ｏ ｌ加入第 二个管中，记为１Ｅ＋０ ｌ。以此类推，重复相同的操作 ＧＴＧＡＴＧ；ＳｉＵＳＰ２２—２（下划线部分为插入的ＳｉＲＮＡ片 段）：ＡＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧ— ＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴ— 直至最后一个管。③选取所需的细胞孑Ｌ，吸去９０ ｌ的 培养基，丢弃，加入９０ ｌ稀释好的病毒溶液，放于培 ＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴｒＡＡＴＴｒｒＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＩＴＣ— ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡ— ＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＣ ＩＴＣＴｒ门［ｔｒＡＡ ｎ ＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＩ１Ｔｒ— 养箱中培养。④培养２４ ｈ后，加人完全培养基１００ ｌ， ４ ｄ后，通过荧光显微镜拍照观察其荧光表达情况。 ⑤根据荧光图片中ＧＦＰ表达情况，如在观察到荧光 ＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣｒ兀１ＧＧＡｒＩ ＩＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡ— 表达的最后一个浓度ｌＥ一４ ｌ组中看到有５个带荧 ＴＡＣＴＡＡＡＴｒＡＴｒＡＴＩＴＩＴｒＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧ— 光的细胞，则说明该孑Ｌ中至少有５个病毒颗粒感染了 ＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＩｒｒＴＧ— 细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病 ＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＦＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴｒＡ— 毒原液量，就是５／（１Ｅ一４）＝５ｘｌＯ ，单位为ＴＵ／Ｉ￣Ｉ，也就 ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＣＡＣＧＡＧＣＡＴＩＴＩ１ＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣ— 等于５ｘ１０ ＴＵ／ｍｌ。 ＴＣＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴｒｒＩ１ＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴ— ２结果 ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣ— ２．１慢病毒表达载体质粒的酶切鉴定及测序 ＧＡＧＧＧＡＣＣＴＡＡｒｒＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴ１１ＡＴＡ— 提取出来的质粒经ｔｔｐａＩ和Ｘｈｏ Ｉ酶切鉴定。进行 ＣＧＡＡＧ１ＴｒＡＴＡ１ＴｒＡＡＧＧＧＴＴＣＣＡＡＧＣＴｒＡＡＧＣＧＧＣＣ— 凝胶电泳形成一条约７．６ ｋｂ的ＤＮＡ条带（图１），与预 ＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴｒＡＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴＩ１ＡＧＴｒＡ一 期结果相符。鉴定正确的质粒被送至北京中美泰和公司 ＩＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡ— 测序，测序结果显示含有与先前设计相同的干扰序列， ＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＩ１ＡＣＡＴＡＡＣＴｒＡＣＧ— 表明ＵＳＰ＇２２慢病毒表达载体质粒构建成功。测序结 ＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣ— 果如下。ＳｉＵＳＰ２２－１（下划线部分为插入的ＳｉＲＮＡ片段）： ＣＣＣＣＣＣＡＴｒＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡ— ＡＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣ— ＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣ１ＴＩＴＣＣＡＴｒＧＡＣＧＴＣＡＡ— ＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴｒＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴ— ＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＩＴＡ ＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴｒＧＧＣ— ＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴｒＪ ＡＴＩＴＩ１ＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＩＴＩ１ＣＣＴＡ— ＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣ— ＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＩ’ＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧ— ＣＴＡＴｌｒＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧ— ＡＴＡＡＴＣＴＧＴＹＣＴｒＩＴＩＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴｒＩＴＡＣＡＴ＿＿ ＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＩＴＣＣＴ— ＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＩＴｒＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴ— ＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴｒＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴ— ＡＡＡＴｒＡＴｒＡＴｒＩＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣ— ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧ。 ＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＩＴＩＴＧＡＧＡＣ— ＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴｒＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴｒ ＡＡＣＴＣ— ．．．．．．．． Ｅ ２已２．．．．．一 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ Ｍａｒｋｅｒ ＡＣＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＩＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴｒＧＴｒＧＡ— ＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴｒ丌【ＴＩＴｒＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ— ＡＴＡＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＡＧＧ— ＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴｒＡＴＡＣＧＡＡ一 （ ＴｒＡＴＡＴｒＡＡＧＧＧＴＴＣＣＡＡＧＣＴｒＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴ— ＧＧＡ Ｉ＇ＡＡＣＣＧＴＡＴＩ’ＡＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴｒＡＧＴＩ’ＡＴｒＡＡＴ＿＿ ＡＧＴＡＡＴＣＡＡ１ＴＩＩＡＣＧＧＧＧＴＣＡｒＩｒｒＡＧ ｒｒＣＡＴＡＧＣＣＣＡ— 一 ｂ ＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴｒＡＣＡＴＡＡＣｒＩＴｒＡＣＧＧＴＡＡＡＴｌ＿ ＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣ—— Ａ ＩＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴｒＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡ— ２．２慢病毒载体的包装以及滴度的测定 ＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣｒＩＴＩＴｒＣＣＡＴｒＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧ— 慢病毒转染２９３Ｔ细胞后。通过孔稀释法来测定 ＧＡＧＴＡＴ丌ＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡ— 其滴度。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的 ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧ— 表达情况．观察到的荧光细胞数随稀释倍数的增加而 ＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴｒＡＴ一 减少（图２）。 ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｖｏ１．２１ Ｎｏ．３２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１ ４ 中国当代医药２０１４年ｌ１月第２１卷第３２期 ・论 著・ 作用，主要起到调整缓释片的释药速率的作用；淀粉 １８（９）：１０９—１１１． 起到稀释剂的作用。 ｆ５】耿放，朱魁元，王发善，等．五加生化胶囊的高效液相色 释放度实验结果表明，五加生化缓释片２ ｈ释放 谱指纹图谱研究［Ｊ］．分析科学学报，２０１２，２８（３）：４０８— 出标示量３０％左右的药物，６ ｈ释放出标示量６Ｏ％左 ４１０． 右的药物，１２ ｈ基本释放药物，各点累积释放量满足 ［６６］中华人民共和国药典第二部［Ｍ】．北京：人民卫生出版 缓释制剂特征。 社，２０１０，附录． ［７】葛裕华，程路峰．释放度测定研究进展【ＪＪ．医科大学 【参考文献】 学报，２００８，３１（８）：７５７—７５８． 【１］何欣欣．五加生化胶囊的药理及临床应用［Ｊ］．吉林医学， ［８】王博，张来华，李苑新，等．亲水凝胶骨架缓释片释药机 ２０１４，３５（１）：９２－９３． 制评价方法和研究进展［Ｊ］．中国医药工业杂志，２００９，４０ ［２］张凤，董玉国．五加生化胶囊药理作用及临床应用［Ｊ】．今 （１０）：７８２－７８５． 日科苑，２００９，１３（８）：２９０—２９１． ［９］陈挺，陈子晟，包泳初，等．国产ＨＰＭＣ作为盐酸普萘洛 【３］张颖智，路娟，宋婷．五加生化胶囊对气虚血瘀模型大鼠 尔缓释骨架片基质的研究『Ｊ］．中国医药工业杂志，１９９８， 血液流变学和细胞内皮因子的影ｎＰ３［Ｊ］．中成药．２０１３，３５ ２９（１）：１０—１６． （７）：１５３５－１５３８． 【１０】徐济恒，马凤余，周亚球．缓释片剂的研究概况［Ｊ］．安徽 ｆ４】耿放，朱魁元，王发善，等．ＨＰＬＣ同时测定五加生化胶 化工，２０１１，３７（１）：２７—３０． 囊中３种有效成分的含量『Ｊ１．中国实验方剂学杂志，２０１２， （收稿日期：２０１４—０７—２８本文编辑：郭静娟） （上接第１２页） ［１１】Ｌｕ Ｘ，Ｈｕｍｅａｕ Ｌ，Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎ Ｖ，ｅｔ ．Ｓａｆｅ ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏ－ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ＵｓＰ ｉｓ ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＳＡＧＡ ｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ａｃｈｉｅｖｅｓ＞ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ—ｃｙ－ ９９％ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｐｒｏ・ ｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００８，２９（１）：１０２—１１１． ｔｏｃｏｌ￣］．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，２００４，６（９）：９６３—９７３． ［１５】Ｚｈａｎｇ ＸＹ，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＨＫ，ｈＴｏｒｎｅ ＡＷ，ｅｔ ａ１．ＵＳＰ２２，ａｎ ｈＳＡＧＡ ［１２】Ｂａｒｔｏｓｃｈ Ｂ，Ｃｏｓｓｅｔ ＦＬ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅ— ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ，ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｅｏｍｂ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ［Ｊ］． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，４（４）：４２７—４４３． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００８，７（１１）：１５２２－１５２４． ［１３】Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ ＭＳ，Ｓｈｉｎ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ 【１６】Ｇｌｉｎｓｋｙ ＧＶ．Ｄｅａｔｈ－ｆｒｏｍ－ｃａｎｃｅｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｏｆ ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，ＵＳＰ２２ ａｎｄ Ｕｓｐ２２ ｆＪ】．Ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅ￣．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００５，４（９）： Ｅｘｐｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ，２００６，６（３）：２７７－２８４． １１７１－１１７５． ［１４］Ｚｈａｎｇ ＸＹ，Ｖａｒｔｈｉ Ｍ，Ｓｙｋｅｓ ＳＭ，ｅｔ ｏ１．Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ （收稿日期：２０１４—０７—０９本文编辑：郭静娟） 医药资讯 河南南阳召开全国第四届骨伤疼痛新疗法学术交流大会 本刊讯（《中国当代医药》记者王伟特约记者周卫忠孟红领崔松涛）ｌ０月２２日，由中华中医药学会、中国中药 协会、中国保健协会主办．北京世针联中医微创针法研究院、中国骨伤微创针刀学术委员会、河南南阳水针刀新针法研 究院承办的中国南阳第二届仲景论坛中医微创论坛暨全国第四届骨伤疼痛新疗法学术研讨会在南阳隆重召开。 本次大会以“弘扬仲景文化学术思想，传承仲景针灸学术理论，加强针灸中医微创针法、软组织损伤病、疼痛病、脊 柱相关病的临床应用”为主题，邀请国内外资深专家学者进行学术交流。 此次大会群贤毕至，名家荟萃。参加此次交流大会的有国家中医药管理局吴刚副，原国家中医药管理局副局 长、中国中药协会房书亭会长，世界针灸学会联合会终身邓良月教授，中华中医药学会李俊德副会长，中国中医药 研究促进会高武常务副会长兼秘书长。人民卫生出版社李剑光主任．北京世针联中医微创针法研究院院长吴汉卿教授 以及来自全国各地的学者和来自新加坡、马来西亚的国际友人。吴汉卿教授致欢迎词，他说：水针刀技术和中医筋骨三 针疗法诞生在医圣故里。多年来，在各位领导及各位专家同仁的大力支持下，该技术从临床实践到理论逐步完善，得到 了海内外医学家的充分肯定与高度评价。在该技术的发展过程中，曾多次受到中医大师和前辈的关心和支持，对此，表 示衷心的感谢，并希望通过此次交流会，各位嘉宾专家能交有所获，学有所悟，学以致用。 中国中医药研究促进会高武常务副会长兼秘书长致辞，并给予吴汉卿教授“古有仲景，今有汉卿”的高度评价。 人民卫生出版社李剑光主任在全国高等中医药院校《水针刀微创技术》系列创新教材发布仪式上做了精彩发言。 各位有丰富ｌ临床经验的专家教授对于醒脑开窍针刺法、铍针疗法、银质针法等手法的临床应用做了详细讲解，国内 外学者共聚一堂，对骨伤疼痛新疗法研究学习。并现场开展了疑难病诊疗中常见问题互动回答、优秀论文交流等活动。 ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｖｏ１．２１ Ｎｏ．３２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１ ４
