生化论文

(1)红细胞外期(exo-erythrocytic cycle，简称红外期)：当唾腺中带有成熟子孢子(sporozoite)的雌性按蚊刺吸人血时，子孢子随唾

液进入人体，约经30分钟后随血流侵入肝细胞，摄取肝细胞内营养进行发育并裂体增殖，形成红细胞外期裂殖体。成熟的红细胞外期裂殖体内含数以万计的裂殖子。裂殖子胀破肝细胞后释出，一部分裂殖子被巨噬细胞吞噬，其余部分侵入红细胞，开始红细胞内期的发育。间日疟原虫完成红细胞外期的时间约8天，恶性疟原虫约6天，三日疟原虫为11～12天，卵形疟原虫为9天。

一般认为间日疟原虫和卵形疟原虫的子孢子具有遗传学上不同的两种类型，即速发型子孢子(tachysporozoites，TS)和迟发型子

孢子(bradysporozoites，BS)。当子孢子进入肝细胞后，速发型子孢子继续发育完成红细胞外期的裂体增殖，而迟发型子孢子视虫株的不同，需经过一段或长或短(数月至年余)的休眠期后，才完成红细胞外期的裂体增殖。经休眠期的子孢子被称之为休眠子(hypnozoite)。恶性疟原虫和三日疟原虫无休眠子。

(2)红细胞内期(erythrocytic cycle，简称红内期)：红细胞外期的裂殖子从肝细胞释放出来，进入血流后很快侵入红细胞。裂殖子

侵入红细胞的过程包括以下步骤：

①裂殖子通过特异部位识别和附着于红细胞膜表面受体；②红细胞广泛性变形，红细胞膜在环绕裂殖子处凹入形成纳虫空泡；③

裂殖子入侵完成后纳虫空泡密封。在入侵过程中裂殖子的细胞表被脱落于红细胞中。

侵入的裂殖子先形成环状体，摄取营养，生长发育，经大滋养体、未成熟裂殖体，最后形成含有一定数量裂殖子的成熟裂殖体。红细胞破裂后，裂殖子释出，其中一部分被巨噬细胞吞噬，其余再侵入其他正常红细胞，重复其红细胞内期的裂体增殖过程

1972年，中国科研人员首次从黄花蒿中分离提取得到了一种治疗疟疾的有效成分，并将其命名为“青蒿素”。青蒿素具有抗疟疾、免疫调节、抗肿瘤和抗真菌等多种药理作用。尤其是在抗疟疾方面，青蒿素具有速效、高效和低毒的优点。鉴于青蒿素良好的抗疟疾效果，世界卫生组织将其推荐为抗疟疾药物。

人类的抗疟疾斗争已有相当长的历史，疟疾发病快、死亡率高、流行性广，是目前除了艾滋病、肺结核以外的最严重的传染性疾病。全球化进程的推进和日益频繁的国际交往，使得疟疾逐渐成为肆虐全球的公共卫生问题，尤其是在非洲区域的国家。多年来，中国的抗疟疾防治工作从整体上看貌似得到了有效的控制，但随着经济的快速发展，不断增加的流动人口使中国抗疟疾工作面临着十分严峻的挑战。疟疾一方面威胁着人类的健康，另一方面，对于发展中国家而言，疟疾对于经济发展仍存在巨大的制约作用 疟疾是疟原虫通过蚊虫叮咬传播后，寄生在人体内引发的传染性疾病。疟疾的发病症状主要表现为：发热、肝脾肿大、出汗、贫血等，除此之外，还会引起脑、肺、肠胃型疟疾，病情严重者还会危及性命。由于疟疾的发病快、流行广和高死亡率特性，使其与艾滋病、肺结核一起被列为国际上3大灾难性疾病。

青蒿素作为继乙胺嘧啶、伯喹、氯喹之后特效的抗疟疾药，尤其对抗氯喹疟疾和脑型疟疾有特殊的疗效。

1971年以来,中医研究院青蒿素研究小组通过整理有关防治疾病的古代文献和民间单验方,结合实践经验,发现中药青蒿乙醚提取的中性部分具有显著的抗疟作用。在此基础上,于1972年从青蒿中分离出活性物质——青蒿素,并于1976年通过化学反应、光谱数据和X射线单晶衍射方法证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内酯,分子式为C15H22O5,

二价铁离子依赖的抗疟疾作用 目前,有关青蒿素类药物的抗疟作用机理仍不清楚,多数人认为二价铁离子介导了青蒿素衍生物的抗疟作用,该作用与青蒿素的化学结构密切相关。在疟原虫破坏红细胞并吞噬血红蛋白后,疟原虫体内的血红蛋白酶,主要是天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶将吸收的血红蛋白催化降解成游离氨基酸,同时释放出血红素和游离的二价铁离子;二价铁离子再催化青蒿素类物质中的过氧桥裂解,产生大量以青蒿素炭原子为中心的自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS),它们将修饰或抑制疟原虫生长所需要的大分子物质或破坏疟原虫生物膜结构,最终导致疟原虫死亡[2]。

抑制血红素的内化 已知血红素经虫体的解毒机制聚合成不溶水的、无活性的结晶物质,即疟色素,其储存于虫体食物空泡内。氯喹对血红素具有较强的亲和力,它通过竞争性结合血红素从而拮抗青蒿素的抗疟作用,但青蒿素能抑制血红素的内化,从而阻断疟原虫对铁离子和蛋白质的利用[3]。去铁胺、苯甲酰腙吡哆醛和1,2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮等铁螯合剂均可渗透入红细胞膜,抑制青蒿素和蒿乙醚的抗疟作用[4]。Hoppe等[5]直接观察到青蒿素可以长时间(12 h)和短时间(5 h)抑制疟原虫对大分子物质的内化,最高抑制率达到85%。这说明血红素必须进入食物空泡内才能释放铁离子,青蒿素抑制血红素内化可能是其抗疟作用机理之一。

1.4 增加细胞内钙离子水平 最近,Eckstein-Lud-wig等[7]认为青蒿素的抗疟疾作用可能与其抑制疟原虫肌浆 内质网膜钙离子依赖的ATP酶(the sarco endoplasmic reticulum calcium-dependent ATP kinase,SERCA)活性有关。疟原虫SERCA与人体的内质网ATP酶功能十分相似。正常情况下,这种酶可以通过将钙离子排出细胞外来调节细胞内的钙离子水平。青蒿素抑制SERCA活性可使细胞内钙离子水平升高,细胞随之凋亡,给予内质网钙离子抑制剂Thapsigargin可以竞争性抑制青蒿素对SERCA的作用。而且,即使青蒿素阻断了疟原虫SERCA的活性,促使细胞死亡,但并不影响正常细胞的钙排出活动[8]。

青蒿素抗疟机制的研究 早期的研究表明,青蒿素选择性杀灭红内期疟原虫的机理主要是作用于疟原虫的膜系结构,使食物泡膜、核膜、质膜破坏,线粒体肿胀皱缩,内外膜剥离,对核内

染色物质也有一定影响,青蒿素及其衍生物通过影响表膜-线粒体的功能,阻断疟原虫营养的供应,从而达到抗疟目的。李锐[6]等经过对鼠疟、猴疟超微结构研究,提出青蒿素及其衍生物通过抑制细胞色素氧化酶,干扰原虫膜系线粒体功能,阻止原虫消化酶解宿主的血红蛋白成为氨基酸,使疟原虫无法得到供给自身蛋白质的原料,而迅速形成自噬泡,导致虫体瓦解死亡。Kannan等[7]提出,青蒿素通过抑制酸性食物中半胱氨酸蛋白水解酶的活性,引起未降解的血红蛋白积聚,从而干扰血红蛋白的降解,最终使原虫缺少合成蛋白质的氨基酸而发挥其抗疟活性。一直以来,对青蒿素类化合物抗疟作用机制的研究中,多数认为青蒿素结构中所含内过氧桥在铁离子的介导下,产生不稳定的有机自由基,然后与蛋白质形成加合物,而杀灭寄生虫[8]。近来,又有很多学者在基因水平上进行研究,认为青蒿素可能通过作用于疟原虫的PfATP6酶而发挥抗疟作用[8]。

诺贝尔奖让青蒿素声名大振, 然而这个神奇的化合物对于我们而言依然充满神秘色彩, 尤其是青蒿素的抗疟机理, 具体来说就是青蒿素是如何抑制引发疟疾的元凶—疟原虫的生长的, 关于这些人们依然知之甚少. 在过去几十年间, 科学家提出了不少相关理论, 引起较大争议甚至混乱, 以至于到目前为止都没有一个理论能够被广泛接纳[3,4]. 药化学家通过各种手段修饰青蒿素化学结构, 得到一些与青蒿素结构不太一样的衍生物(图 1), 但是值得一提的是, 这些类似物均含有青蒿素药学活性的主要结构—双氧桥. 按照传统思维方法青蒿素的活性靶点应该是疟原虫体内的某个(些)蛋白质, 这些蛋白质的活性可以被青蒿素特异抑制. 然而如果确实存在这个蛋白靶点, 那一个令人倍感困惑的事情就是, 这样一类化学结构如此多变的分子是如何定位到疟原虫体内的某一类特殊蛋白质上的? 此外, 我们知道很多药物是以某一特殊构象起作用的, 青蒿素却不然, 人们合成了它类似物的对映异构体, 发现它们具有相同的抗疟活性, 这些结果似乎与已有的药物作用经验相悖.

血红素(heme)模型是众多解释青蒿素作用机理的模型之一, 虽然细节上有些变化, 该模型假设青蒿素通过与血红素作用产生自由基然后伤及如液泡等细胞器. 这个模型曾风靡一时, 亚铁血红素的确容易与青蒿素发生化学反应, 加之疟原虫在其生活特定阶段确实会积累许多亚铁血红素来形成疟色素—脱毒晶体状血红素. 然而到目前为止都没有令人信服的数据来支持这个假说, 甚至一些数据与该模型不甚吻合, 例如, 抑制血红素降解第一步反应的蛋白酶抑制剂 Ro40-4388 与奎宁有拮抗作用, 但与青蒿素既无拮抗作用, 也无协同作用, 提示与亚铁血红素的相互作用对青蒿素抗疟作用可能不是必需的. 除此以外, 青蒿素不止在疟原虫将血红蛋白降解为血红素的红内期具有抗疟作用, 其他时期同样可以抑制疟原虫的生长. 另一个较为相似的青蒿素作用模型是铁离子模型: 铁离子以某一形式如亚铁离子、亚铁血红素或 Fe-S 基团与青蒿素反应介导青蒿素的抗疟作用. 此外还有一些蛋白靶点(TCTP, Pfmdr1, Pfcrt和PfATP6)假说.

青蒿素具有特殊的药理学性质，对疟疾有非常好的治疗效果。在青蒿素的抗疟疾作用过程中，青蒿素通过干扰疟原虫体内的表膜-线粒体功能，导致虫体结构的全部瓦解。这个过程主要分析为：青蒿素分子结构中的过氧基通过氧化产生自由基，自由基与疟原蛋白结合，进而作用于疟原虫的膜系结构，破坏其泡膜、核膜以及质膜，使其线粒体肿胀且内外膜脱落，最终破坏疟原虫的细胞结构和功能，在这个过程中，疟原虫细胞核内的染色体也会受到影响。光学和电子显微镜观测结果显示，青蒿素可以直接进入疟原虫的膜系结构，可以有效地阻断疟原虫依赖的宿主红细胞浆的营养供给，进而对疟原虫的表膜—线粒体功能造成干扰（而非干扰其叶酸代谢），最终导致疟原虫虫体的全部瓦解。青蒿素的应用还会使疟原虫摄入的异亮氨酸的量大大减少，从而抑制疟原虫虫体内蛋白质的合成[6]。

除此之外，青蒿素的抗疟效果还与氧气压力有关，高的氧气压会使青蒿素对体外培养的恶性疟原虫的半数有效浓度降低。青蒿素对疟原虫的破坏作用分为2种，一种是直接破坏疟原虫；另一种是损坏疟原虫的红细胞，进而导致疟原虫死亡。青蒿素的抗疟疾作用对疟原虫红细胞期有直接的灭杀效果。而对红细胞前期和外期都无明显的影响。与其他抗疟药不同的是，青蒿素的抗疟机理主要依赖青蒿素分子结构中的过氧基。过氧基的存在对青蒿素的抗疟活性起决定性作用，如无过氧基团，青蒿素将会失去抗疟活性。因此可以说，青蒿素的抗疟机理与过氧基的分解反应密切相关。

由于疟原虫的抗药性，单纯的青蒿素药物已不能满足抗疟的要求，因此催生了多种青蒿素衍生物的合成，以应对疟原虫的抗药性。青蒿素类衍生物是在保留青蒿素分子骨架的基础上，引入或去掉一些会大大影响青蒿素抗疟活性的基团。例如，青蒿素分子结构中的酮基经过还原反应后形成的双氢青蒿素的抗疟活性强于纯青蒿素。另外，酮基还原后衍生出的羧酸酯类、醚类、碳酸酯类衍生物的研究也很广泛。这些衍生物结构上的变化极有可能是由于影响药物在体内与受体的结合、药物的传输过程或影响对疟原虫有毒杀作用的活性物质的稳定性来改变其抗疟活性[6,7]。另一方面，青蒿素纯物质在使用过程中还存在近期复发率高的问题，因此通过合理用药、改变剂型、研发复方青蒿素等途径来解决这一问题。目前已有十几种青蒿素衍生药物的抗疟效果优于青蒿素纯物质[7]。 4 自由基和氧化损伤假说

由于青蒿素类抗疟药化学结构中含有一个过氧基团,而且一旦该过氧桥结构被破坏,其抗疟活性便随之消失。这种结构特点使人们很容易联想,它们的抗疟作用机理可能和它们在体内产生游离基和活性氧有关。因此,合乎逻辑的推理是,青蒿素类抗疟药特异性地浓集在疟原虫细胞内并释放出活性氧或产生自由基,从而对疟原虫的膜系统或生命大分子产生氧化损伤。然而目前尚缺乏足够的实验证据支特这种假说,尽管也积累了一些零散的实验依据。不少科研人员实验表明青蒿素类抗疟药可以产生自由基,其中靳氏等[23]采用电子自旋共振波谱法测定青蒿琥酯在体内外代谢转化过程中产生自由基情况的实验结果肯定了上述假说,不仅如此,产生的自由基进一步引发脂质过氧化和组织损伤。使用抗氧化剂维生素 E 可以抑制该药自由基的产生,减轻脂质过氧化及组织损伤。虽然该文是一篇研究青蒿琥酯的毒理学文章,但至少可以表明青蒿素类药物在体内可以产生自由基,既然这些自由基可以造成机体的组织损伤,也有可能杀伤疟原虫。有人提出疟原虫的死亡可能是青蒿素在体内产生的活性氧引起的[24]。还有人提出青蒿素产生的自由基作用于疟原虫蛋白质引起疟原虫蛋白失活[25]。现在占主流的是“两步作用学说”：首先,青蒿素的过氧基结构被活化产生自由基；然后自由基作用于疟蛋白,形成共价复和物,使疟蛋白失活从而产生抗疟活性[26]。此外,有人发现青蒿素类的抗疟作用可能是通过作用于疟原虫的血色素而实现的[27]。青蒿素类抗疟药的抗疟活性可以被氧化剂(包括过氧化氢酶)、自由基清除剂(如维生素 E)所抑制。青蒿素-血红素复合物能氧化细胞膜上的巯基,而单独使用青蒿素则不能氧化细胞膜上的巯基,所以青蒿素类化合物通过血红素铁离子的氧化还原作用而产生抗疟活性。其中的铁离子起着至关重要的作用,铁离子能催化有机过氧化物的分解而产生自由基,这些自由基可以损伤有机体的膜系结构或者烷化生物大分子,从而造成生物体的死亡。青蒿素类抗疟药就是过氧化物,所以疟原虫中的游离铁,尤其是血色素的铁可能催化青蒿素类药物中的过氧桥断裂而产生自由基。自由基再对生物大分子发生损伤作用(烷化、攻击巯基等),从而达到抗疟药效。

疟原虫可寄生于人体的肝细胞和红细胞中（图3）。虽然青蒿素抗疟疾的分子机制仍不明确，但青蒿素依赖过氧桥的自由基形成并发挥抗疟作用是明确的。以前有人认为，青蒿

素主要作用于疟原虫吞食血红蛋白后产生的疟色素（hematoin），疟色素中的螯合铁可以使青蒿素的过氧桥还原，从而大量形成氧自由基杀死疟原虫[6]。另一种理论认为，青蒿素可能打破细胞的氧化还原循环，因为青蒿素能抑制疟原虫消化泡膜上的谷胱甘肽-S-转移酶[7]。

有人以酵母为模型研究青蒿素作用机理，结果发现青蒿素靶向酵母菌的线粒体，其中的电子传递链可激活青蒿素释放活性氧自由基（ROS），导致线粒体膜去极化[8]。随后的研究证实，青蒿素只攻击疟原虫的线粒体，而且作用于线粒体时并不抑制呼吸中的电子传递，表明青蒿素作用的特异性可能源于自我催化[9]。

最近有人提出一个新的假说，认为氧自由基导致疟原虫ATP酶（PfATP6）受到抑制，由此阻断其能量代谢过程而致死[10]。PfATP6被确认为青蒿素作用靶点的证据是：青蒿素也能抑制哺乳动物 钙 ATP 酶（SERCA）[11]；PfATP6 与SERCA突变能调节对青蒿素的敏感性[12]；用去污剂使PfATP6与SERCA液化，两者对青蒿素都不敏感[13]。 疟原虫可寄生于人体的肝细胞和红细胞中（图3）。虽然青蒿素抗疟疾的分子机制仍不明确，但青蒿素依赖过氧桥的自由基形成并发挥抗疟作用是明确的。以前有人认为，青蒿素主要作用于疟原虫吞食血红蛋白后产生的疟色素（hematoin），疟色素中的螯合铁可以使青蒿素的过氧桥还原，从而大量形成氧自由基杀死疟原虫[6]。另一种理论认为，青蒿素可能打破细胞的氧化还原循环，因为青蒿素能抑制疟原虫消化泡膜上的谷胱甘肽-S-转移酶[7]。 血红素降解第一步反应