工业循环冷却水中异养菌的测定

1 适用范围

本规程适用于工业循环冷却水中异养菌的测定，还适用于原水，生活用水及其他水中异养菌的测定。

2 引用标准

GB 603 化学试剂 试验方法所用制剂及制品的制备。 GB6682 分析实验室用水规格和试验方法。

3 方法概要

本法采用平皿计数技术在29±1℃培养72h来测定循环水中的异养菌总数。

4 试剂和材料

本试验测定方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB 6682中三级水规格的水。 4.1 牛肉膏（生化试剂）； 4.2 蛋白胨（生化试剂）； 4.3 氯化钠（GB1266）；

4.4 氢氧化钠（40g /L）溶液：称取10g氢氧化钠溶解在一定水中，加水定容到1000mL,搅匀。

4.6 盐酸溶液（1+11）：量取浓盐酸10mL 溶解到110mL水中，混匀。

4.7 乙醇溶液75%（V/V）： 量取394.7mL95%乙醇溶解到一定量水中，加水稀释到500mL，混匀。 4.8 牛皮纸； 4.9 医用脱脂棉； 4.10医用脱脂纱布；

5 仪器和设备

5.1 无菌箱（室）或超净工作台； 5.2 蒸汽压力灭菌器； 5.3 生化培养箱；

5.4 电热干燥箱（温度可控制在60~280±2℃）； 5.5 刻度吸管1mL； 5.6 刻度吸管5mL； 5.7 刻度吸管50mL； 5.7 磨口锥形瓶100mL； 5.8 容量瓶1000mL； 5.9 培养皿￠90mm；

5.10 锥形瓶500mL； 5.11 搪瓷量杯1000mL； 5.12 取水样瓶500mL； 6 试验前的准备

6.1 培养基的制备称取下列试剂：牛肉膏3.0；蛋白胨10.0g；氯化钠5.0g；

琼脂15.0g；将上述试剂加水约950mL,在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000mL。用氢氧化钠溶液（4.5）或盐酸溶液（4.6）调节PH值至7.2±2，并分装在500mL锥形瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。 6.2无菌稀释水制备

6.2.1生理盐水的配制：称取8.50g氯化钠溶解在1000mL水中，混匀。

6.2.2将生理盐水（6.2.1）分装在100mL磨口锥形瓶中，每个锥形瓶塞子和瓶口间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.3 刻度吸管的灭菌。

6.3.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适

宜，长度大约10~15mm,棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。

6.3.2 每支刻度吸管用1条约40~50mm宽的牛皮纸条，以45°左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上刻度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h。

6.4培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在仪器，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h 。 6.5取水样瓶的灭菌：将洗净并烘干后的取样瓶，于160±2℃灭菌2h。

7 测定步骤

7.1 样品的采集

7.1.1 打开水阀，用取样瓶取水样。

7.2 无菌箱（室）灭菌把试验所用的无菌稀释水，无菌培养皿、无菌吸管等用品放入无菌箱（室）内，打开紫外线灯灭菌30min。 7.3 水样的稀释和接种

7.3.1 水样（7.1.1）放入灭过菌的无菌箱（室）（7.2）中，立即用75%（V/V）乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱（室）内的酒精灯。7.3.2~7.3.7的操作应在无菌箱（室）内的火焰区进行。

7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后平皿上生长的菌落数小于300个。在空白稀释水样瓶（6.2）上标上稀释度数。

7.3.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管（6.3）吸取5mL水样（7.1.1）注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10ˉ1。

7.3.4 另取一支5mL 无菌吸管吸取5mL稀释度为10ˉ1水注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10ˉ2。依次类推，直至需要的稀释度为止。

7.3.5 将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养皿（6.4）中，每个稀释度重复接种3~5皿，每皿接种1mL,接种时左手手撑托住培养皿，大拇指和食指轻轻将培养皿盖提起，使右手中的吸管恰好插入，吸管与培养皿底成45°角相接，移开吸管时吸管不宜再碰到培养皿，接种时间不宜超过4s,每接一个稀释度更换一支无菌吸管。

7.3.6 另取一组培养皿不接水样，作为空白。

7.3.7 将灭过菌的培养皿基（6.1）冷却至45±1℃，按（7.3.5）掀开培养皿盖，将培养基灌入培养皿内，每皿应灌15~20mL,灌皿时不要使培养基直接灌在水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘。测定一个水样从接种到灌皿不得超过20min。

7.4 培养待培养皿中培养基（7.3.7）固化后，倒置平皿，在生

化培养箱中29±1℃培养72h。

8 计数与报告

8.1 培养之后，取出培养皿，若空白培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。

8.2 选择平均菌落数在30~300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成二位有效数字（见表例1）。 8.3 若有二个稀释度，其生长菌落数均在30~300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字（见表例2及例3）。

8.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养皿计数（见表例4）。

8.5 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释最低的培养皿计数（见表例5）。

8.6 若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数”报告之（见表例6）。

8.7 若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养皿计数（见表例7）。

8.8 以个/mL表示循环冷却水中异养菌的数量按下列公式计算： 异养菌（个/mL）=X/ F×V

式中：X—按（8.2）方法计数得出的培养皿上生长的平均菌落数，个，

V—取稀释水样的体积，mL, F—水样稀释倍数， 例表

例 次 1 2 3 4 5 6 7 稀释度及菌落数 10ˉ 10ˉ 10ˉ -- -- -- >6500 27 0 -- 164 295 271 估计3475 11 0 306 20 46 60 313 5 0 12 稀释度菌粘液形成落数之比 菌总数 个/mL -- 16400 1.6 37750 2.2 27100 -- 313000 -- 270 -- <1×10 -- 30600 报告方式个/mL 1.6×10 3.8×10 2.7×10 3.1×10 2.7×10 <10 3.1×10 9精密度

9.1 由于微生物能以单独个体，双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存在的活细胞的数目。

9.2 标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，每皿加1mL样品时测定结果的置信度为95%。 10 备注

本规程参照GB/T14643.1编制