茶树内生木霉种的鉴定及其在植物体内的定殖

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ISSN1672-72 CN11-5180Q

©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.

茶树内生木霉种的鉴定及其在植物体内的定殖

武汉琴 苏经迁 谢明英 杨民和

福建师范大学生命科学学院 福州 350108

摘 要：采用分离自健康茶树叶片组织的一株长枝木霉Trichoderma longibrachiatum 菌株CSN-18，研究茶树内生木霉的人工接种、再分离及其在茶树地上部组织中的内生性。该菌在PDA培养基上生长速度快，产孢量大。用CSN-18回接茶苗，接种后一个月可以从茶苗的茎和叶组织中再分离获得该真菌。接种后的茶苗没有观察到明显的病害表现；与对照相比，接种后6个月组培苗生长良好，叶色更绿；接种后1个月，实生苗生长正常。通过石蜡切片和苯胺蓝染色，在已接种的茶树组培苗的叶片内部组织中可观察到木霉的存在，从而证明了木霉能够在茶树地上部组织内定殖，是茶树的一种内生真菌。 关键词：长枝木霉，人工接种，定殖

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An endophytic Trichoderma species from Camellia sinensis: its characterization and endophytism

WU Han-Qin SU Jing-Qian XIE Ming-Ying YANG Min-He*

College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China

Abstract: Fourteen strains of endophytic Trichoderma were isolated from healthy tea plant by using conventional isolation method. The strain Trichoderma longibrachiatum CSN-18 was used as inoculum for studying its endophytism in tea seedlings. The strain grew quickly in PDA media and yielded masses of conidiospores. After being inoculated to tea seedlings, the endophytic Trichoderma longibrachiatum CSN-18 was re-isolated from the seedlings in 30 days. The tea seedlings inoculated with Trichoderma longibrachiatum CSN-18 did not show any disease symptom, and the tissue-cultured seedlings grew better than un-inoculated seedlings in 6 months. The presence of the fungus in the leaf tissues was studied by means of paraffin-cut section dyed with aniline blue. The results showed that the fungus was observed on the surface and in inner tissues of leaves, indicating that Trichoderma longibrachiatum strain CSN-18 could establish colonization in ground portion of tea seedlings as an endophyte. Key words: Trichoderma longibrachiatum, artificial inoculation, colonization

基金项目：福建省自然科学基金重点项目（No. B0620005）

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Corresponding author. E-mail: minhe214@fjnu.edu.cn

收稿日期: 2008-06-25, 接受日期: 2008-12-19

Vol.28 No.3 343

茶树病害90%是地上部的真菌病害，是严重制约茶叶生产和导致茶园用药量居高不下的重要因素之一。在茶树内生真菌的系统分离过程中，我们从不同来源的茶树材料中分离获得14株木霉的分离物，并采用形态学和分子生物学相结合对这些木霉分离物进行了初步的鉴定。本研究选用其中的一株长枝木霉Trichoderma longibrachiatum Rifai CSN-18，进一步研究木霉的人工接种和观察木霉在茶叶细胞中的定殖和内生性。该研究的结果将为茶树病害的防治提供一条新思路。

1.2.4 木霉的鉴定：形态鉴定，对从茶树叶片中分离获得的一株内生木霉进行鉴定，观察木霉菌落形态、颜色，分生孢子梗的分枝、着生情况和分生孢子的形态，测量孢子大小和孢子梗长度，结合培养性状并参考Gams & Bissett（1998）、文成敬等（1993）的木霉分类方法，进行初步的鉴定。分子鉴定，采用改良后的SDS方法（杨月梅等 2007）提取总DNA，利用一对ITS通用引物（ITS4-ITS5）进行PCR扩增，这对引物的扩增区包含了ITS1、5.8S和ITS2完整区域。引物由上海生物工程有限公司合成。ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

PCR反应体系：10 × Buffer 1.5µL，dNTP（2.5mmol/L）1µL，引物 ITS4/ITS5（20µmol/L）各1µL，模板RNA 2µL，Taq RNA 聚合酶0.2µL，ddH2O加至15µL。按照上述顺序分别加入，PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。扩增片段按上海申能生物科技有限公司的试剂盒回收PCR产物，与pMD18-T载体（TaKaRa，大连）16℃连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞100µL JM109。阳性克隆经菌落PCR和质粒插人片段鉴定正确后，由上海生物工程有限公司完成碱基序列测定。将测序获得的ITS序列通过与GenBank中核酸数据库序列进行 Blast分析。利用Clustal X软件包构建系统发育树，进行亲缘关系和系统发育分析。

1.2.5 木霉的人工接种：木霉置于PDA培养基上28℃培养至孢子形成90%以上，用无菌水洗菌落孢子配成浓度为1－2×106孢子/mL的孢子悬浮液备用。茶树组培苗接种，取10瓶生长一致的组培茶苗，将木霉用打孔器自平板上取直径为5cm的菌块，然后将菌块放入组培茶苗的基部，每株茶苗放一块。另设10瓶组培苗作为对照。培养15－30d后观察结果。茶树实生苗的人工接种，在2006年8月16日分别采用孢子涂抹和针刺接种，在2007年6月3日采用涂抹接种。每次人工接种取5盆4月龄健壮、无病虫的盆栽茶苗（每盆2棵茶苗），将木霉接种于所有叶片和茎干上，另取5盆作为对照。接种真菌孢子后，保湿培养2d，其后继续培养，至

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株：木霉Trichoderma spp. 菌株由本实验室从健康茶树组织中分离获得并保存。 1.1.2 供试茶苗：组培茶苗由中国农业科学院茶叶研究所提供，在本实验室内扩增，品种为大理茶。实生茶苗由本实验室培养获得，茶树种子购自福建省农业科学研究院茶叶研究所，品种为铁观音。 1.2 方法

1.2.1 茶树组培苗的培养：茶树组培苗增殖条件：培养基成分MS + BA 2mg + NAA 0.1mg + GA3 3.0mg，培养温度25±2℃，光照时间为12h，光照强度2000－3000lx。20d左右为一个继代周期（周健等 2005）。

1.2.2 茶树实生苗的培养：种子在清水中浸泡3d，挑选沉入水底的健壮种子，经表面消毒后，播种于花盆中。待茶苗长出后，用于内生真菌的人工接种。无菌茶树实生苗的培育参照戴清良等（2008）方法。 1.2.3 内生真菌的分离：在福建省福州市、安溪县、建瓯县及江西省庐山等不同地点的茶园，挑选表面光滑、健康的茶树材料，冲洗干净，自然凉干后将茎切成1cm左右的小段，叶片切成0.5 × 0.5mm的小块，用75%的酒精漂洗1min，再用3%次氯酸钠溶液（活性氯）浸泡5min，无菌水冲洗3－4次，每次5min。经表面消毒的组织块适当晾干后，接种到PDA固体培养基上培养，每个培养皿中接入6个组织块。置于25－28℃温箱培养5－7d，长出菌丝后挑取边缘部分移接到新的平皿上纯化培养，将木霉接入试管斜面上保存备用。

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不同时间观察茶树苗的病害表现，或用于木霉的再分离。

1.2.6 人工接种茶苗的内生真菌再分离：分别在人工接种后15d和30d，取以上茶树组培苗或实生苗，用于内生真菌的再分离，以验证木霉在茶苗体内的存在和分布。真菌分离方法同前所述。

1.2.7 木霉定殖的显微观察：接种一个月后的组培茶苗叶片做石蜡切片，观察木霉在茶苗体内的形态及存在位置。

1.2.8 数据分析：1.2.6得到的数据用以下公式计算分离率：分离率=100 ×（有内生菌的组织块数/总组织块数）。得到10棵实生茶苗茎、叶的内生木霉分离率的平均值，应用ANOVA进行方差分析。

黄绿色（图1-A）。分生孢子梗分枝简单，长而直，瓶梗不规则排列，基部次级分枝比上部次级分枝长，常单生或互生或几个轮生，一般朝向分枝的顶部，很少再次分枝，终极瓶梗顶部明显很细，中部略粗，基部很少有缢缩，呈圆柱状或瓶状。产孢细胞大小为6.0－12.5 × 2.0－3.0µm。分生孢子光滑，倒卵形，单生或串生（图1-B），大小为3.5－5.0 × 2.0－2.5µm。

扩增获得的ITS序列全长为661bp（GenBank No. FJ041152）（图2），将该ITS序列，使用BLASTN 2.2.18（Mar-02-2008）在GenBank + EMBL + DDBJ + PDB基因库中进行同源性搜索，该菌株与木霉属ITS序列相似性达90%以上。综合同源性比对结果和该木霉在真菌发育系统中位置，从GenBank中选择了8个菌株的ITS基因序列，应用Bioedit 7.0和Treedrawing软件进行多重比较后构建系统发育树。结果表明，该菌株与一株长枝木霉（图3）

Trichoderma longibrachiatum Rafai在一个分支中，与此菌株的进化距离最近，初步将菌株CSN-18鉴定为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum Rafai。 2.2 人工接种后茶苗生长情况和木霉的再分离

对茶树组培苗的内生木霉人工接种表明，木霉在MS培养基上生长良好。接种后15－30d，偶尔可见木霉在茶苗体上产生明显的菌丝丛和分生孢子，但茶树苗生长良好。和对照相比，大多数组培苗植株叶色浓绿。接种后6个月，茶苗生长正常，未见明显的不良影响。经组织表面消毒后，从组培苗的叶片和茎部均可分离获得木霉，表明木霉已侵入茶苗组织内部。

2 结果与分析

2.1 木霉的分离与鉴定

经表面消毒的茶树组织块在培养3－4d后，逐渐可见有菌丝从组织块的切口出。其中占优势的内生真菌属于球座菌属Guignardia spp.、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis spp.、刺盘孢属Colletotrichum spp.的真菌（谢丽华等 2006）。分离获得的内生木霉均来自茶树的叶片组织。在茶树内生真菌的分离培养过程中发现，木霉既可以从茶叶组织块中直接长出，也可以是从其它的真菌菌落上生长而来。如其中有4株木霉生长自球座菌的菌落，因为在球座菌长出茶叶组织块16d后，才见木霉从球座菌的菌落上生长出来。在PDA平板培养基上，菌落生长迅速，初呈白色，后转为浅绿或深绿，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现密集的毡状，背面呈绿色或

图1 茶树内生木霉在PDA培养基的菌落形态（A）及菌体特征（B）

Fig. 1 Colony (A) and conidiophores (B) of endophytic Trichoderma longibrachiatum on PDA medium.

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茶树实生苗经人工接种后，在涂抹接种的茶苗叶片和茎部未见明显的病害症状；针刺接种的茶树苗，接种初期可见在针刺部位呈现红褐色小点（伤口），但伤口未见进一步扩展，其后伤口慢慢愈合，红褐色逐渐消退。接种后30d，从23个实生茶苗的茎组织块分离得到20个分离物，其中木霉的分离率为58%；从32个实生茶苗的叶片组织块分

图2 菌株CSN-18 rDNA ITS区扩增产物

M：200bp DNA marker；1、2为菌株CSN-18.

离得到9个分离物，全部为木霉，分离率为16.2%（图4，图5）。对照组没有长出任何真菌。

ANOVA进行方差分析结果表明：茶苗接种木霉CSN-18后，从茎、叶中的分离率有显著性差异（df=8，F=46.053，p>0.05），说明木霉更容易从茶苗的茎部进入茶树的组织内。

Fig. 2 PCR amplification products of Trichoderma longibrachiatum strain CSN-18 rDNA ITS. M: 200bp DNA marker; 1 and 2: Strain CSN-18.

图3 基于rDNA ITS序列的系统发育树 分支处数字代表支持强度.

Fig. 3 Phylogenetic tree of Trichoderma spp. based on the rDNA ITS sequence.

图4 人工接种后30d茶苗组织再分离获得CSN-18 A：叶片；B：茎.

Fig. 4 Re-isolation of Trichoderma longibrachiatum CSN-18 from tea tissues in day 30 after inoculation. A: Leaf; B: Stem.

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成功感染茶树组培苗，进入到茶树体内。

3 小结与讨论

本研究中，通过培养特性、形态学和对rDNA ITS序列的分析，初步确定了菌株CSN-18为长枝木霉 Trichoderma longibrachiatum Rifai。据我们所知，长枝木霉作为植物叶片中内生真菌的研究，目前还未见报道。

内生真菌侵入植物体内后，一般只能作有限的

图5 人工接种后30d CSN-18在茶树组织中的再分离

Fig. 5 Re-isolation of endophytic Trichoderma longibrachiatum CSN-18 in day 30 after inoculation.

生长，生长到一定程度即停止扩展，菌丝存在于植物细胞间或细胞内。本研究表明，CSN-18可以侵入叶片组织内，既可存在于茶叶细胞之间，也可存在于茶叶细胞内，这与前人所得出的结果基本相似（Herre et al. 2007；戴清良等 2008）。茶树组培苗接种条件下，观察到CSN-18接种后组培苗长势比对照组好，叶色明显更绿；但在实生苗条件下，没有观察到明显的促生作用。可能在实生苗条件下，生长环境更为复杂，影响因素更多，因而效果不明显。但茶树组培苗和实生苗的人工接种均表明CSN-18对茶树苗没有明显的致病作用，符合Sieber （2007）所提出的、根据科赫法则（Koch’s postulates）改进的验证内生真菌的4点要求。Evans et al.（2003）和Bailey et al.（2006）采用刚发芽的可可 Theobroma cacao 种子作为接种材料，成功地验证木霉的内生性。接种12周后，在幼苗的根、主茎和枝条部位能再分离获得木霉，但在叶片中没

2.3 木霉在茶苗体内定殖的显微观察

在清水中，木霉CSN-18分生孢子不易发芽；但在PDA培养液中，在培养24h孢子即可发芽，芽管细长（图6-A）。接种到茶苗后，石蜡切片后经苯胺蓝染色，显微观察结果显示在茶叶表面可以观察到大量的、有时呈堆积分布的菌丝，表明木霉在组培茶苗的叶面生长良好。木霉可以侵入茶叶组织内部，但一般分布于叶部组织的外层1－3层细胞，很少观察到菌丝细胞在茶叶深层细胞中的分布。菌丝细胞既可分布于寄主细胞之间（图6-B，下面箭头所示），也可分布于寄主细胞内（图6-B，上面箭头所示）。同时，采用内生真菌的分离方法对组培苗进行分离，所得微生物均为木霉，也说明木霉已

图6 茶树内生木霉显微观察 A：分生孢子发芽；B：木霉CSN-18在茶叶组织中的分布.

Fig. 6 Microscopic observation of endophytic Trichoderma longibrachiatum CSN-18. A: Spore germination; B: Endophytic colonization in leaf tissue of tea seedling. A and B: bar=10µm.

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有分离到（Evans et al. 2003）。在内生木霉接种后，可可树苗的基因表达发生明显的变化，但不同的木霉接种后的互作结果不同，表现出种的特异性（Bailey et al. 2006）。可可生木霉Trichoderma theobromicola接种生长8周的可可幼苗后，从所接种的植株的茎部均可分离到木霉，但在叶片中也没分离到（Samuels et al. 2006）。本研究中，我们采用组培苗和实生苗作为接种材料，接种后在植株的茎杆和叶片中均分离到所接入的木霉菌株CSN-18。结合显微观察的结果，说明CSN-18可以在茶树叶片组织中成功定殖。CSN-18能在茶树的枝、叶中同时定殖，表明它可能有更好的植物组织适应性。

传统上，木霉被认为是一类典型的土壤真菌，因其强大的生态竞争能力和对许多病原菌的抑制作用而被认为是有良好应用价值的生防菌（Harman et al. 2004；Samuels et al. 2006）。植物地上部组织中生长有复杂的内生真菌群体（Lindow & Brandl 2003）。内生真菌能影响植物的抗虫性、抗病性和其它的抗逆性，因而对植物生长和作物生产可能产生有益的影响（Arnold et al. 2003；Arnold & Lewis 2005；Herre et al. 2007；Rodriguez et al. 2008；Walker et al. 2005）。当前，内生微生物在促进植物生长、增强抗逆性过程中的作用，逐渐为研究者所重视（Morrissey et al. 2004；Rubini et al. 2005；Wicklow et al. 2005）。木霉作为重要的生防资源，在植物根部病害的防治中已发挥一定的作用，但木霉在植物根际的定殖是影响其生防效果的瓶颈（Harman et al. 2004）。真菌进入植物体内后，受外界环境因素的影响程度将明显减弱。因此，利用一些木霉菌株在植物体内的内生特性，防治植物的地上部组织病害，如茶树的叶部病害，可以更全面地发挥木霉在植物促生防病中的作用。

致谢：浙江大学生物技术研究所章初龙博士对本文提出宝贵意见，特此致谢！

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